Способ определения L-аминокислот Советский патент 1988 года по МПК G01N27/46 C12P13/04 

(21)4120397/31-13

(22)02.07.86

(46) 07.04.88. Бюл. № 13

(71)Институт биохимии АН ЛитССР

(72)Ю. Ю. Кулис, М. В. Песлякене и .В.-С.А. Лауринавичюс

(53)663.15(088.8)

(56) White W. G., Guilbault G. G. Lysine specific enzyme electrode for determination of Lysine in Grains and Foodstuffs. - Anal. Chem, 1978, V. 50, p. 1481-14.

laniello R. M., Jacynyh A. M., Immobilized Enzyme Chemically Modified Electrode as an Amperometrie Sensor. - Anal. Chem, 1981, v. 53, p. 2090-2095.

(54)СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ L-АМИНОКИС- ЛОТ

(57) Изобретение касается исследования и анализа материалов путем определения тока и может быть использовано для определения L-аминокис- лот. Цель изобретения - упрощение процесса и повышение селективности определения L-аминокислот. Для этого в иммобилизованную мембрану окси- дазы L-аминокислот вводят перокси- дазу, электролиз проводят в слабощелочном буферном растворе в присутствии ферроцианида калия в концентрации 1-2 мМ. при ОБ на графитном электроде без предварительной его модификации химическим путем относительно Ag/AgCl электрода сравнения и концентрацию L-аминокислот определяют по увеличению катодного тока. 1 ил., 5 табл.

9

(Л

с

00 00

сг

00 00

оо

Изобретение относится к электрохимическим методам анализа материалов, а именно к способу количественного определения L-аминокислот путем измерения тока при электролизе во время ферментативных реакций.

Целью изобретения является упрощение процесса и повьшение селективности определения L-аминокислот.

На чертеже показана схема измерительной ячейки для осуществления способа.

Способ включает электролиз исследуемого вещества в слабощелочном фосфатном буфере с использованием графитного электрода, покрытого мембраной иммобилизованной оксидазы

H Oj+fFe (CN) + 2Е пероксидаза 2 Ре (CN) . (1)

Количество добавляемой в мембрану пероксидазы должно быть таким, чтобы реакция, катализуемая перок- сидазой по уравнению (1), бьша быстрой, т.е. не лимитировала общий процесс. Для этого достаточен 10- 50-кратный избыток пероксидазы по сравнению с.оксидазой L-аминокислот по активности. Выход за верхний предел не требуется и нецелесообразен экономически. Кроме того, при увеличении концентрации фермента увеличивается толщина мембраны, в результате увеличивается ответ электрода и уменьшается его чувствительность.

Восстановление образующегося фер- роцианида на графитовом электроде при О В приводит к генерации катодного тока, величина которого пропорциональна концентрации L-аминокис- лоты.

Предлагаемый способ не требует химической модификации графитного электрода, таким образом упрощается процесс. Повьшение селективности обеспечивается тем, что электролиз проводится при О В, а при этом потенциале основные электрохимически активные вещества не окисляются и величины фоновых токов при введении проб реальных образцов не превьппа- ют 1%. Поэтому концентрации L- ами- нокислот в реальных средах определяют по калибровочному графику для чистого.раствора.

Измерительная ячейка состоит из корпуса I, изготовленного из орга0

L-аминокислот, и электрода сравнения из Ag/AgCl и измерение тока в ячейке при взаимодействии фермента с субстратом, перед электролизом в буферный раствор вводят ферроцианид калия в концентрации 1-2 мМ, в иммобилизованную мембрану оксидазы L-аминокислот дополнительно вводят перокси- дазу, а графитный электрод используют без химической модификации, электролиз проводят при О В и кон- - центрацию L-аминокислот определяют по увеличению катодного тока.

В ферментной мембране, содержащей оксидазу L-аминокислот и перок- сидазу, кроме окисления L-аминокис- лоты, происходит превращение по схе- е.

5

0

5

0

5

0

5

нического стекла и содержащего входной и выходной патрубки для промывки и заполнения ячейки буферным раствором, и измерительной камеры 2 с магнитной мешалкой 3, в которую помещены рабочий графитный электрод 4, покрытый иммобилизованной мембраной 5 и электрод 6 сравнения из Ag/AgCl и которая содержит верхнее отверстие для введения пробы. Промывка и заполнение измеритель.ной камеры буферным раствором осуществляют при помощи двухканального перистальтического насоса. Рабочий . и вспомогательный электроды присоединены к полярографу с самописцем-.

В измерительную ячейку объемом 1 мл, содержащую буферный раствор с ферроцианидом калия, вводят 0,05 мл раствора L-аминокислоты. При взаимодействии фермента с субстратом измеряются параметры ячейки. После анализа ячейка промывается 1,5 мин струей буфера, после чего можно проводить следующее измерение.

Пример 1. Определение концентрации L-лейцина.

Для приготовления фep eнтнoй мембраны 3 мг оксидазы L-аминокислот, 10 мг пероксидаэы и 16 мг сывороточного альбумина растворяют в 0,2 мл 0,01 М фосфатного буферного раствора рН 7,5, 0,1 М КС1. Смесь обрабатывается 5 мкл 5%-ного глутарового альдегида и выливается на диализную мембрану площадью 6 см. Высушенная при 4 С мембрана, толщина которой 50 мкм, надевается- прямо на графитный электрод и прикрепляется резиновым кольцом.

Определение L-лейцина при помощи приготовленного ферментного электрода проводят в 0,01 М фосфатном буфере рН 7,5, содержащем 0,1 М КС1 и 2 мМ ферроцианида калия, потенциал графитного электрода 0,0 В относительно Ag/AgCl электрода.

Данные изменения катодного тока при изменении концентрации добавленного L-лейцина приведены в табл. I.

Из табл. 1 видно, что прямолинейность калибровочного графика наблюдается до 0,8 мМ L-лейцина.

Пример 2. Определение концентрации различных аминокислот.

Ферментная мембрана и ферментный электрод изготавливаются аналогично примеру 1. Определяется ток в буферном растворе, содержащем разные аминокислоты: 0,01 М фосфатный буфер рН 8,0, 0,1 М КС1, концентрация ферроцианида калия 1,5 мМ, концентрация аминокислот 0,5 мМ. Условия определения, как в примере I.

Результаты представлены в табл. 2.

Из табл. 2 видно, что наилучшим субстратом для оксидазы L-аминокис- лот является L-лейцин, однако можно определять и L-метионин, L-ji-фенил- аланин, L-триптофан, L-изолейцин, L-аргинин. D-Анинокислоты, L-аланин L-аспарагин, L-треонин и L-пролин практически не мешают определению.

Пример 3. Определение зависимости тока ячейки от концентрац ш ферроцианида калия и рН буферного раствора.

Каталитическая мембрана и ферменный электрод изготовлены, как в примере 1. Определяется концентрация L-лейцина в зависимости от концентрции ферроцианида калия в фуберном растворе рН 7,8, концентрация L-лейцина 1,0 мМ. Условия определения, как в примере 1.

Данные приведены з табл. 3,

Из табл. 3 видно, что ток ячейки зависит от концентрации ферроцианид калия в буферном растворе.

При увеличении концентрации медиатора до 1 М ток увеличивается, а при концентрации соединения выше 1 1 практически не меняется. Таким образом, способ реализуем при концентрации медиатора выше 1 мМ, а с

0

5

0

5

0

5

0

5

целью экономии реагента оптимальная концентрация 1 мМ.

Показания электрода зависят от рН буферного раствора. Так, при наличии в ячейке 0,6 мМ L-лейцина при рН 6,0 ток ячейки 390 пА, при рН 6,5 - 450 нА, при рН 70 - 485 нА, при рН 7,5 - 480 нА, при рН 8,0-- 482 нА, при рН 8,5 - 465 нА, при рН 9,0 - 436 нА. Таким образом, интервал рН 7-8 является оптимальным.

Пример 4. Определение концентрации L-лейцина в средах выращивания микроорганизмов.

Каталитическая мембрана изготовлена, как в примере 1. Среды для выращивания микроорганизмов приготовлены путем растворения соответствующих количеств L-лейцина в культу- ральных средах. Измерения проводятся, как для чистых растворов, концентрация L-лейцина определяется по калибровочному графику для чистых растворов. Условия определения, как в примере 1.

Данные измерений представлены в табл. 4.

Из табл. 4 видно, что точность определения (т.е. коэффициент вариации) не превышает 3%. Остаточный ток в средах не превышает 0,5-1,0%, так как вещества, находящиеся в реальных растворах, являются электрохимически неактивными при нулевом потенциале графитного электрода.

Пример 5. Определение стабильности электрода во времени.

Ферментный электрод изготовлен, как в примере 1. Концентрация L-лейцина 0,5 мМ. Условия определения, как в примере 2.

Результаты зависимости тока от продолжительности сохранения электрода представлены в табл. 5.

Из табл. 5 видно, что работоспособность электрода сохраняется в течение 2 мес.

По сравнению.с известным предлагаемый способ определения L-амино- кислот является более простым, экспрессивным и селективным, так как отсутствуют операции предварительной обработки образцов, химической модификации электрода и определения влияния других веществ, которые находятся в биологических реальных средах. Быстрота анализа особенно важна в микробиологической промышленности при непрерывном контроле уровня L-аминокислот.

Формула изобретения

13868836

дующим определением концентрации Ьгаминокислот по увеличению тока, отличающийся тем, что, с целью упрощения процесса и повышения селективности, перед электроСпособ определения L-аминокис-пот, лизом в буферный раствор вводят ферро- включ ающий электролиз исследуемого цианид калия в концентрации 1-2мМ, в вещества в буферном растворе с ис- иммобилизованную мембрану оксидазы пользованием графитового электрода™ JQ L-аминокислот дополнительно вводят покрытого мембраной иммобилизован- пероксидазу, при этом электролиз веной оксидазы L-аминокислот, и элек- дут при нулевом потенциале относи- трода сравнения из Ag/AgCl с после- тельно электрода сравнения.

Таблица I

Ток, мкА

0,107 0,220 0,326 0,432 0,538 0,700 0,830 0,905

Ток, мкА

0,21 0,36 0,55 0,66 0,73 0,80 0,82 0,80 0,81 0,81

Ток, мА 464 480 472 410 365tl5 330t30 320tlO 220 145 134 130 (29 128 125 123

Таблица 4