Способ получения кининазы Советский патент 1982 года по МПК A61K35/56 

(5) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ КИНИНАЗЫ

ИзЬБретение относится к области биологии и касается методов выделения ферментов из сырья животного происхождения, . Известен способ получения кининазы из.сырья животного происхождений, включающий гель(|)ильтрацию с последующей элюцией буферным раствором и ионообменную хроматогра(1)ию Однако известный способ не обеспечивает получение фермента с достаточно высокой ферментативной активностью (0,07 мкг экв. на 1 мг белка в 1 мин). Целью изобретения является повышение (|)ерментативной активности. Поставленная цель достигается тем, что в способе получения кининазы из сырья животного происхождения, включающем гельфильтрацию с по следующей элюцией буферным раствором и ионообменную хрома то гра(, в качестве источника сырья используют 1ЯД паука Latrodectus tredecingiittatus, который подвергают гельфитрации на сефадексе G-50 с элюцией О,005 М аммонийацетатным буферным раствором, затем полученную первую фракцию разделяют ионообменной хроматогра(|)ией на колонке с диэтиламиноэтилцеллюлозой и элюируют фермент аммонийацетатным буферным раствором. Пример. Выделенный яд паука каракурта в количестве 1 г разделяют на сефапексе G-50 в 0,005 М аммонийацетатном буфере рН , размер колонки (2, см), скорость вытекающей жидкости 30 мл/ч. Б результате разделения яда получают три фракции. Высокая кининазная активность обнаружена только в первой фракции, ее объем составляет 5 мл, содержание белка 660 мг, вторую фракцию получают в количестве 35 мл и третью фракцию в количестве 35 мл, но не используют. Для дальнейшей очистки первую фракцию («5 мл) разделяют на колонкё с диэтиламиноэтилцеллюлозой размером (2, см) в градиенте аммонийацетатного буфера рН 7)8, скорость 18 мл/ч, об-ъем 3 мл„ Всего получено шесть фракций. Первая, вто рая и третья фракции десорбируют из колонки при ступенчатом методе элюции 0,05 М (250 мл), 0,1 М (250 мл) 0,2 М (250 мл), аммонийацетатным буфером рН 7-8с Использование в дальнейшем гради ентного метода элюции, начиная от 0,2 М (300 мл) - 0,5 М (200 мл), бу ферного раствора рН позволяет получить еще три фракции„ Высокую кининазную активност удалось обнаружить только в третьей фракции из шести выделенных Ее удельная актив ность превысила активность цельного ядя в 10 раз Электролиз в полиакриламидном ге показал, что. третья фракция дает од :но пятно, мигрирующее к анодУ, что свидетельствует о чистоте выделенно го фермента, В результате разделени яда методом гель-фильтрации и ионообменной хроматографии получили гом генную кининазу с удельной активномкг экв белка мин. в количеств 200 мг. Таким образом, получили фермент кининазы, превосходящий по своей удельной активности известные до сих пор получейные кининазы„ По своим свойствам этот фермент также отличается от известных. На основании экспериментальных данных фермент отнесен к классу тио вых соединений Оптимальная рН этого фермента и она устойчива при рН 6,5-9. Предлагаемый способ позволяет получить фермент с высокой активностью, что дает возможность, использовать его в модельн| 1х опытах по выяснению , свойств и функций отдельных компонентов кининовой системы, -помогающих скрывать интимные механизмы процесса, .происходящих в живом организме, а Также правильно понять роль кининаз в патоголических изменениях организма при уксусах пауков. Это даст возможность изыскивать новые лекарственные средства при укусах ядовитых пауков. Формула изобретения Способ получения кининазы из сырья животного происхождения, включающий гельфильтрацию с последующей элюцией буферным раствором и ионообменную хроматографию, отличающ и и с я тем, что, с целью повышения ферментативной активности, в качестве источника сырья используют яд паука Latrodectus tredecinguttatus, который подвергают гельфитрации на сефадексе G-50 с злюцией 0,005 М аммонийацетатным буферным раствором, затем полувоенную первую фракцию разделяют ионообменной хроматографией на колонке с диэтиламиноэтилцеллюлозой и элюируют фермент аммоний-ацетатным буферным раствором. Источники информации, принятые во внимание при экспертизе 1о Margolliss J. Висе S. Release of bradt. kinin - like substance (BKtS) In sheep fy renopa of Crotalus atrox. Austral, I. tx and Meg. Sle V. k3, I 3, 1965.