Способ получения слизистых форм энтеропатогенных эшерихий и шигелл Советский патент 1992 года по МПК C12N1/20 C12N1/20 C12R1/70 

Изобретение относится к способам выделения микроорганизмов и может быть использовано для получения слизистых форм энтеропатогенных эшерихий (ЭПЭ)

и шигелл«

Известен способ получения слизистых форм Escherichia call 012А: К72, заключающийся в приготовлении таких питательных сред, как аминопептидный бульон (АПБ), аминопептидный агар 1,5 - 2,0% (АПА), среда с пенициллином (АПБ 4- 20% сахарозы +0,2% MgS04+ + 1200 ЕД/мл пенициллина), минимальная среда (Ш4)эР04 г, КгНР04 1 г, Na-SO 0,2 r, MgS04 г, глюкоза 5 г, НгО - до 1 л, РН 7,2-7,Ь, АПА + + % пептона (АПА с пептоном). Первый этап способа заключается в получении пенициллиновых сферопластов. Для этого исходную R-форму E.coli выращивают на АПБ и в логарифмической фазе роста вносят а среду с пеницилли ном на З-1 ч при 37°С. Сферопласты получены с

Второй этап заключается в осуществлении реверсии, т.е. Сферопласты следует вернуть в исходную R-форму (ревертанты). Для этого 0,1 мл взвеси сферопластов вносят в минимальную среду с последующей инкубацией при 37° С в течение 1 сут, после чего культуру выдерживают при 28 С 243 сут. При этом Сферопласты превращаются в исходную R-форму, обозначенную как ревертант. Для их выделения в виде изолированных колоний культуру с минимальной среды пересевают на АПА с пептоном. Инкубация при 37°С в течение 1 сут. Вырастают изолированные колонии ревертантов - исходная R-фрр- ма получена. Затраты времени составляют й-5 сут.

Третий этап заключается в получении слизистых форм. Для этого с ревер- тантами проводят процедуры, как на первом и втором этапах, повторяя получение сферопластов и снова ревертантов . В лучшем случае слизистые фор§

(Л

СЈ 00 00 Јъ СО

1738849

мы колоний получают на АПА с пептоном после проведения 4-7 циклов реверсий. Таким образом, слизистые формы появляются минимум на 16-20-е сутки. Выделение в чистой культуре требует еще 1 сут.

Известный способ характеризуется сложностью, трудоемкостью и большими временными затратами.

Целью изобретения является упрощение способа.

Поставленная цель достигается путем посева взвеси исходной R-формы ЭПЭ и шиггел на плотную питательную среду, содержащую бактериофаг Т3 с последующим выращиванием в течение 1 сут при 37е С и выделением появляющихся слизисТгых форм колоний в чистой кулътуре.

Пример. Получение слитистых форм ЭПЗ и шиггел по предлагаемому способу.

Изучение литических свойств фага Т

ли ЭПЗ и шигелл

Результаты приведены в табл« 1 о

Как видно из приведенных в табл. 1 результатов, фаг Tj избирательно лизи рует R-формы и не влияет на М-вариант бактерий. По-видимому, это связано с

i.j, проводили методом стекающей кап- - на засеянных газоном культурах

тем, что фаг Т3 адсорбируется на более коротких цепях липополисахарида (ЛПС) R-форм энтеробактерий и не может крепиться на специфических поли- сахаридных цепях М-вариантов микробов. Продуцируемая М-клетками слизь экранирует рецепторы фага 7, свободные у шероховатых бактерий.

Суточную бульонную культуру gella sonnei в исходной R-форме центрацией 5 Ю КОЕ/мл в объем 0,1 мл засевают шпаделем на сел ную среду АПА+ТЭ. Через 1 сут и ции при 37°С вырастают слизисты нии в количестве 100-120 иа чаш Суточную бульонную культуру

35 flexneri la в исходной R-форме центрацией 5108 КОЕ/мл в объем 0,1 мл засевают шпаделем на сел ную среду АПА+ТЗ. Через t сут и

ции при 37 С вырастают слизисты

Эти данные подтверждают возможность 0 нии в количестве 5-ТО на чашку.

использования фага Т3 для реализации способа получения слизистых форм как единственного селективного агента в качестве компонента питательной среды.

Приготовление селективной питательной среды.

В расплавленный и остуженный до 43°С АПА добавляют бактериофаг Тз в конечной концентрации примерно 107 - 80 БОЕ/мл, после чего разливают по чашкам Петри. Среда АПА+Тз получена. Вместо АПА может быть использован казеиновый агар (КА), среда ЭНДО и другие среды, не ингибирующие литические свойства бактериофага.

Получение слизистых форм.

Суточную бульонную культуру E.coli 0124:К72 в исходной R-форме с концентСпособ испытан на 40 штаммах li 0124:К72, 2 штаммах E.coli О 12 штаммах Sh.sonnei и 2 штамма flexneri la.

45 Сводные результаты испытаний дены в табл. 2.

Как видно из приведенных в т результатов, выход слизистых фо составляет 100$ .поскольку из вс

50 ценных 56 штаммов, взятых в R-ф ЭПЭ и шигелл, удалось получить жительный эффект.

Можно добавить, что повышени центрации бактерий за счет осаж

55 путем центрифугирования исходно бульонной культуры или сбора их жая с агаризованной среды (исхо R-культура может быть выращена

рацией 5 Ю КОЕ/мл в объеме 0,1 мл засевают шпаделем на селективную среду АПА+ТЗ Через 1 сут инкубации при 37 С вырастают слизистые колонии в количестве 40-60 на чашку.

Суточную бульонную культуру E.coli OJ24:K72 в исходной R-форме с концентрацией 5- Ю8 КОЕ/мл в объеме

0,1 мл засевают шпаделем на селективную среду КА+Т3. Через 1 сут инкубации при 3/°С вырастают слизистые колонии в количестве 40-60 -на чашку.

Суточную бульонную культуру E.coli

5 0124:К72 в исходной R-форме с концентрацией 5xtl)8 КОЕ/мл в объеме 0,1 мл засевают шпаделем на селективную среду ЭНДО + Т3. Через 1 сут инкубации при 37°С вырастают слизистые

0 колонии в количестве 40-60 на чашку. , Суточную бульонную культуру E.coli 0143 в исходной R-форме с концентрацией 510 КОЕ/мл в объеме 0,1 мл засевают шпаделем на селективную среду

5 АПА + Tj. Через 1 сут инкубации при 37°С вырастают слизистые колонии в количестве 20-30 на чашку.

Суточную бульонную культуру Shi- gella sonnei в исходной R-форме с концентрацией 5 Ю КОЕ/мл в объеме 0,1 мл засевают шпаделем на селективную среду АПА+ТЭ. Через 1 сут инкубации при 37°С вырастают слизистые колонии в количестве 100-120 иа чашку. Суточную бульонную культуру Sh.

5 flexneri la в исходной R-форме с концентрацией 5108 КОЕ/мл в объеме 0,1 мл засевают шпаделем на селективную среду АПА+ТЗ. Через t сут инкуба0

ции при 37 С вырастают слизистые колонии в количестве 5-ТО на чашку.

Способ испытан на 40 штаммах E.coli 0124:К72, 2 штаммах E.coli ОТ43, 12 штаммах Sh.sonnei и 2 штаммах Sh. flexneri la.

Сводные результаты испытаний приведены в табл. 2.

Как видно из приведенных в табл. 2 результатов, выход слизистых форм составляет 100$ .поскольку из всех изуценных 56 штаммов, взятых в R-форме ЭПЭ и шигелл, удалось получить положительный эффект.

Можно добавить, что повышение концентрации бактерий за счет осаждения

путем центрифугирования исходной бульонной культуры или сбора их урожая с агаризованной среды (исходная R-культура может быть выращена на

плотной среде), а также длительная инкубация исходной R-культуры в бульоне, например до 3 сут,ведет к накоплению слизиртых форм в популяции и, | как,следствие, к повышению эффектив- , ности отбора. Однако это практически не требуется, если речь идет о получении колоний (субштаммов) слизистой формы, а не о выделении десятков М-клонов из одной R-культуры.

Проведенные исследования позволяют считать, что способ может быть использован для получения слизистых форм ЭПЭ и шигелл.

Формула изобретения

Способ получения слизистых форм энтеропатогенных эшерихий и шигелл путем посева культуры в R-форме на питательную среду с последующим инкубированием посевов и выделением «мис- той культуры слизистых форм бактерий, отличающийс я тем, что, с целью упрощения способа, посев культуры в R-форме осуществляют на питательную среду с бактериофагом Т9.

Использование: медицина, ветери я нария, бактериологическая диагностика кишечных заболеваний. Сущность изобретения: культуру энтеропатогенных E.coli или шигелл в R-форме высевают на поверхность плотной селективной питательной среды, в которую предварительно внесена суспензия фага Тз в концентрации 107 - 109 БОЕ/мл. Посевы инкубируют в течение 1 сут при 37 С. Выросшие слизистые колонии пересевают для получения чистой культуры. Слизис- тые формы образуются у всех 56 изученных штаммов энтеробактерий. 2 табл. /

1селектив- I « ная среда |

Вид и I Число | Селектив- I Частота полу- серовар (штаммов 1 ная среда I чения М-форм

Таблица 1

Таблица 2

1селектив- I « ная среда |

| Селектив- I Ч 1 ная среда I ч