Изобретение относится к медицине, а более конкретно к микробиологии и иммунологии.
Целью изобретения является упрощение и ускорение способа. Эта цель достигается тем, что в среду для выращивания В. anthracis вводят в концентрации 15-20% коммерческую лечебную антисибиреязвенную сыворотку, содержащую антитоксические антитела, которые в специальных условиях ингибируют рост токсигенных клеток, но не ингибируют рост вариантов, не имеющих плазмиды токсигенности, т.е. атоксигенных.
Этот неизвестный ранее для В. anthracis эффект проявляется в первые 18- 24 ч инкубации, при последующем выращивании Тох+ - клетки прорастают. Дальнейшее упрощение и ускорение способа достигается зй счет отказа от необходимости исследовать выросшие колонии на отсутствие (наличие) токсинопродукции по
вышеперечисленным тестам, применяемым в известном способе.
Описанные принцип и система выявления атоксигенных вариантов в полной мере осуществимы на бескапсульных штаммах В.. anthracis. Поэтому при необходимости получения атоксигенных вариантов из популяции капсульных штаммов необходимо предварительное выделение из них бескап- сульныл клонов..
Испытуемую культуру засевают на полусинтетическую среду известного состава (Haines et al., 1965) с добавлением агарозы. Данная среда обеспечивает получение изолированных колоний атоксигенных вариантов В. anthracis. Посевы инкубируют в течение ч. при 37°С в атмосфере 6- 25% С02. Посевной материал наносят на плотную среду.в дозе, не меньшей 10°-10 клеток.
Сочетание указанных приемов позволило достичь указанной цели и обеспечить
ел
С
со
О vj
О
3
токсигенность всех получаемых вариантов . anthracis.
Пример 1. Получение атоксигенных ариантов из популяции бескапсульных акцинных штаммов В. anthracis СТИ и терне.
Готовится среда следующего состава Haines В. W., Klein F. a. Lincoln R. Е. uantitative assay for crude anthrax toxins //J. acteriol. - 1965. - v. 89- № 1. - P. 74-83), г/л:
CaCl2 2 H207,36 MgS04 7 H20 9,9 MnS04 H20 0,9 KH2P04 680,0 К2НРСм 872,0 NaHCOa 9900,0 Тиамин HCI 0,5 Аденин-сульфат 2,0 Урацил 1,4 Л-триптофан 52,0 Л-цистеин 1,0 -Л-глицин 15,0 Казаминовые кислоты 3600,0 Глюкоза 2000,0 .Агароза . До 2% Дистиллированная вода До 1 л рН среды . 8,5 Непосредственно в день работы в расплавленную и охлажденную до 45°С среду вносят коммерческую лечебную антисибиреязвенную сыворотку до 20%, бикарбонат и глюкозу; среду разливают в чашки Петри. Инокулум В. anthracis для посева на среду готовят в концентрации 10 клеток на 1 мл. Засевают на пластинки среды пипеткой по 0,1 мл или петлей из агаровой колонии 1-2 сут возраста. Общее количество клеток внесенных на пластинку агара должно быть не менее 105.
Чашки инкубируют при 37°С в атмосфере С02 (от 6 до 25%) в течение 18-24 ч. Вырастающие колонии являются атоксиген- ными вариантами, их отсевают на свежую среду иглой. Колонии, вырастающие после 26 ч.инкубации, являются Тох+-вариантами. Атоксигенность полученных клонов по предлагаемому способу удостоверяется методами ин виво (заражение крыс линии Фишер или внутрикожной пробой на морских свинках с культуральной жидкостью исследуемых клонов) и ин витро (иммунодиффу- зия с антитоксической сывороткой и плазмидный анализ).
Пример 2. Получение атоксигенных вариантов из популяции капсульнь х вирулентных штаммов В. anthracis 88/1 и 44/1. Взвесь спор (не менее 10 /мл) по 0,1 мл высевают на пластинки упомянутой среды,
содержащей 20% нормальной лошадиной сыворотки. Посев инкубируют 1-2 сут в атмосфере 6-25% С02 при 37°С. Среди выросших слизистых колоний (капсульные клоны)
отбирают шероховатые колонии или секторы колоний (бескапсульные клоны). Последние высевают на данную среду с антисибиреязвеиной сывороткой (см. при- мер 1) и через 1 сут снимают атоксигенные
клоны.
Пример 3. Получение атоксигенных вариантов В. anthracis СТИ и Стерне в присутствии разных концентраций иммунной сыворотки. Все этапы работы те же, что и в
5 примере 1, за исключением того, что сыворотку вводят в концентрации 10,15, 25,30%. Результаты отражены в табл. 1.
Таким образом, оптимальной концентрацией антисибиреязвенной сыворотки для
0 получения Тох вариантов является 15-25%. Пример 4. Получение атоксигенных вариантов В. anthracis Сти и Стерне в зависимости от концентрации посевного, материала. Все этапы опыта те же, что и в
5 примере 1, за исключением того, что дозы посевного материала варьировали: 10 , 10 , 105 и 107 спор. Результаты отражены в табл. 2.
Таким образом, оптимальной для п.ол0 учения Тох вариантов является посевная доза 105-107 спор.
При м.е р 5. Получение атоксигенных вариантов В. anthracis Сти и Стерне в зависимости от концентрации С02. Все этапы
5 опыта те же, что и в примере 1, за исключением того, что посевы выращивали при разных концентрациях С02. Результаты отражены в абл. 3,
Из табл. 3 видно, что существенным
0 фактором является наличие С02 в инкубаторе (при концентрации газа меньше чем 6% наблюдается недифференцированный рост обоих типов колоний). Повышение концентрации газа более 6% не влияет на результат.
5П р и м е р 6. Получение атоксигенных вариантов при различных сроках инкубации.
Все этапы опыта те же, что и в примере 1, за исключением того, что посевы выращи0 вали 10, 18, 24 и 36 ч. Результаты отражены в табл. 4.
Таким образом, оптимальный срок инкубации культур по предлагаемому способу 18-24ч.
5 Суммируя вышеизложенное можно заключить, что предлагаемый способ позволяет получать атоксигенные варианты В. . anthracis, Последние могут найти применение при генетических исследованиях (для изучения признака токсинообразования у
микроба, для внедрения в бесплазмидные штаммы любых других плазмид с полезными свойствами), а сам способ может быть применен при исследовании соотношения числа Тох+ (иммуногенных) и Тох (неимуно- генных) клеток в популяциях культур В. anthracis, предназначенных для использования в качестве вакцин.
Формула изобретения Способ получения атоксигенных вариантов возбудителя сибирской язвы путем посева спор в питательную среду, инкуби0
рования в условиях, обеспечивающих элиминацию плазмиды токсигенности,с последующим пересевом и скринингом колоний на плотной питательной среде, отличающийся тем, что, с целью упрощения и ускорения способа, для посева используют плотную питательную среду, включающую 15-25% лечебной антисибиреязвенной сыворотки, засевают спорами в концентрации 10-107 кл/см3, а инкубируют при 37°С в атмосфере 6-25% углекислого газа в течение 18-24 ч.
Таблица 1
Использование: микробиология, сибирская язва, возбудитель, атоксигенность, отбор, селекция. Сущность изобретения: в плотную питательную среду вводят в концентрации 15-25% коммерческую лечебную антитоксическую сыворотку, засевают 105- 10 спор культуры, ингибируют при 37°С в атмосфере 6-25% углекислого газа в течение 18-24 ч и колонии атоксигенных клонов отсевают иглой на свежую среду. Способ обеспечивает атоксигенность всех полученных вариантов В. anthrans. 4 табл.
Зависимость выхода Тох - вариантов от различных концентраций антисибиреязвенной
сыворотки
Обозначения: + - наличие колоний Тох - вариантов - - отсутствие роста х - совместный рост Тох и Тох+ - вариантов.
Учет роста Тох - колоний пр разной посевной дозе
Обозначения те же, что и в табл. 1
± - редко встречающиеся Тох -колонии.
Таблица 3 Зависимость выхода Тох - вариантов от различных концентраций СОа
Обозначения те же, что и в табл. 1
Таблица 2
.7. 1807079 8
Таблица 4 Учет роста колоний Тох -вариантов при различных сроках инкубации
| СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АТОКСИГЕН- НЫХ ВАРИАНТОВ ВОЗБУДИТЕЛЯ СИБИРСКОЙ ЯЗВЫ |
