Способ контроля чистоты проламина Советский патент 1992 года по МПК G01N21/35 

Изобретение относится к биотехнологии растений, технической биохимии и может быть использовано в качестве способа определения степени чистоты белков в процессе их выделения из растительного материала.

Известны способы контроля чистоты препаратов проламина, которые заключаются в экстракции небелковых веществ органическим растворителем, удаления растворителя и определении веса сухого остатка примесей. При этом степень чистоты белкового препарата оценивают по содержанию экстрагируемых небелковых примесей (в % к исходной навеске препарата). К недостаткам указанных методов следует отнести трудоемкость и длительность проведения экстракции, большой расход органических растворителей. Применение

органических растворителей или их смеси, как правило, не приводит к исчерпывающей экстракции примесей, прочно связанных с белковой макромолекулой, что снижает достоверность оценки степени чистоты препарата.

Наиболее близким техническим решением является способ, согласно которому очищенный препарат помещают в чашку Петри и определяют три индекса цветности на специальном приборе, измеряющем степень отражения интегрального светового потока (индекс L), а также отраженных красного и зеленого (индекс а), желтого и синего света (индекс в). Затем определяют аналогичные цветовые индексы стандартного образца (обезжиренная соевая мука). Степень чистоты определяют по величине трех цветовых индексов анализируемого препарата

в сравнении со стандартным образцом и количеству остаточных липидов.

Недостатками способа-прототипа являются трудоемкость, длительность анализа, необходимость использования большого количества образца (20г). Способ не позволяет контролировать процесс очистки только по оптическим параметрам образца и требует проведения дополнительной экстракции липидных примесей.

Целью изобретения является упрощение способа.

Для достижения цели проводят подготовку образца препарата к анализу путем отливки пленки из раствора на оптическое стекло. Измеряют инфракрасный спектр проламина на спектрофотометре в области 2800-3700 см . определяют значения оптической плотности в максимумах поглощения при 2925-2930 и 3295-3310 и рассчитывают их отношения. Белок считывается чистым, если это отношение попадает в интервал 0,35-0,55.

Интервал значений волновых чисел максимумов поглощения при 2925-2930 и 3295-3310 обоснован экспериментально.

В качестве иллюстрации способа приведены спектры поглощения проламина сорго- до очистки (чертеж, кривая 1) и после гель- фильтрации на сефадексе LH--20 (чертеж, кривая 2).

Пример.В качестве чистых стандартных препаратов для установления диапазона значений показателя Di/Da использовались проламины, очищенные методом гель-фильтрации на сефадексе LH- 20. что является общепринятой процедурой для очистки проламиновых белков. Например, для очищенного указанным методом препарата зеина содержание основного компонента (белка), найденного известным методом, составляет 99,1 %.

Исследовали ИК-спектры этих препаратов проламина пшеницы (глиадин) и кукурузы (зеин), предварительно очищенных методом гель-фильтрации на колонке с се- фадексом LH-20 в 70%-ном этаноле. Для подготовки тонкой пленки образца к анализу раствор 3 мг препарата в 0,5 мл 70%-ного диоксана наносили на оптическое стекло из флюорита и высушивали под вакуумом. ИК- спектры проламинов получали на приборе Спекорд М-80 в области 2800-3700 . Оптические плотности Di/Da в максимумах поглощения при рассчитывали по методу базисной линии. Значения сравнительного показателя Di/Da приведены в табл.1 (ошибка измерения не более 5%).

П р и м е р 2. Исследовали ИК-спектры проламинов, выделенных из зерна злаковых культур путем экстракции 70%-ным эталоном после отделения альбуминов и глобулинов. Очистку проламинов и получение ИК-спектров проводили аналогично примеру 1, Результаты определения сравнительного показателя проламинов до и после гель-фильтрации приведены в табл.2 (ошиб0 ка измерения не более 5%).

ПримерЗ. Зеины выделяли из размолотого зерна кукурузы (линия А 204 о2/о2) после трехкратного обезжиривания муки петролейным эфиром путем экстракции пя5 тикратным объемом 70%-ного этанола. Ли- офилизированный белковый препарат очищали путем переосаждения. Для проведения очистки белок растворяли в минимальном объеме 70 % этанола и прибавляли

0 охлажденный до минус 20иС ацетон (соотношение раствора белка и ацетона 1:9 по объему),Осадок,отделенный центрифугированием при 3000 об/мин в течение 15 мин, представляет собой зеин по5 еле обработки ацетоном, а надосадочная жидкость - ацетоновый экстракт. Затем проводили гель-фильтрацию препарата зеина на колонке с сефадексом LH-20 в растворе 70%-ного этанола и получали I и II

0 хроматографические фракции. ИК-спектры зеинов на различных стадиях очистки получали аналогично примеру 1. результаты определения приведены в табл.3 (ошибка измерения не более 5%).

5Величина критерия Di/D2 позволяет

контролировать эффективность очистки препарата зеина на различных стадиях. Так, после обработки ацетоном показатель для зеина уменьшается более, чем в 2 раза, на0 против, ацетоновый экстракт представлен, в основном, небелковыми веществами (D 1/D2 9,25).

Значение показателя после гель-фильтрации дает возможность сделать вывод о

5 том. что I хроматографическая фракция является чистым белковым препаратом (Di/D2 0,41), тогда как II фракция представлена небелковыми веществами (Di/D2 2.67).

0 П р и м е р 4. Исследовали аналогично примеру 1 ИК-спектр зеина, полученного экстракцией 86%-ным изопропанолом из глютена (сопутствующий продукт кукуру- зо-крахмального производства) по извест5 ной методике. Максимумы поглощения в ИК-спектре препарата составили 2920 и 3300см 1 соответственно. Значение показателя D1/D2 находится в интервале, установленном для очищенных проламинов, и составляет 0,43.

Формула изобретения Способ контроля чистоты проламина, заключающийся в определении оптического параметра длч образца и в сравнении его величины со значением для очищенного образца, отличающийся тем. что. с целью упрощения способа, отливают на оптическом стекле пленку проламина из раствора

в 70% -ном диоксане, высушивают ее пол вакуумом, регистрируют ИК-спектр в области 2800-3700 см , в качестве оптического параметра определяют отношение оптических плотностей в максимумах полос поглощения при 2925-2930 см и 3295-3310 и сравнивают полученное значение со значением для очищенного образца 0.35-0.55.

Использование: изобретение может быть использовано в биотехнологии растений, практической биохимии для определения степени очистки белков в процессе их выделения из растительного материала. Сущность изобретения: проводят подготовку образца препарата к анализу путем пленки из раствора проламина в 70%-ном диоксане на оптическое стекло, высушивают ее под вакуумом, регистрируют инфрак- расный спектр проламина в области 2800-3700 , определяют значение оптической плотности в максимумах поглощения при 2925-2930 и 3295-3310 и рассчитывают отношение оптических плотностей в максимумах полос поглощения. Сравнивают полученное значение со значением для очищенного образца 0,35-0,55. Попадание отношения оптических плотностей в указанный интервал свидетельствует о чистоте препарата. 1 ил., 3 табл.

Таблица 1

Таблица 2

ч

QX

г

f ю

§

§

Таблица 3