Штамм гибридных культивируемых клеток животных MUS.мUSсULUS, используемый для получения моноклональных антител к @ -субъединице гонадотропных гормонов человека Советский патент 1990 года по МПК C12N5/00 A61K39/395 

Изобретение относится к гибридом- ной технологии и может быть использовано для иммунологического определения уровня гонадотропных гормонов в биологических жидкостях организма.

Цель изобретения - получение штамма гибридных культивируемых клеток, продуцирующих моноклональные антитела (монАТ), специфичные к о(-хориони- ческому, civ-лютеинизирумщему, ликулостимулирующему и е(-тиреотроп- ному гонадотропинам человека.

Штамм получают следующим обра- эом.

В качестве антигена использован препарат хорионического гонадотро- пина человека (ХГЧ).

Мышей линии BALB/c иммунизируют внутрибрюшинно по следующей схеме: в 1-й день - 500 ед. препарата в смеси с полным абъювантом Фрейнда (ПАФ) на 14 и 28-й дни - по 250 ед. препарата с ПАФ, реиммунизация на 56-й день - 2500 ед, препарата ХГЧ в забуфербн- ном физиологическом растворе хлорида натрия. Через 72-96 ч после реимму- низации у мыши стерильно удаляют селезенку и готовят суспеняию спленоел ел ел

СО ©

цитов. Клетки селезенки мыши BALB/c иммунизированной препаратом ХГЧ, сливают (гибридизуют) с клетками мыши- ной миеломы X 63.Ag8.653. Сливающий агент ПЭГ-1500 (50% раствор). Селекцию проводят на среде HAT, два клонирования методом лимитирующего разведения (1 клетка на 3 лунки), 100% позитивных клонов.

Полученный штамм гибридных клеток обозначен D85 . Штамм хранится в Специализированной коллекции перевиваемых соматических клеток позвоночных Всесоюзной коллекции клеточных культур под номером ВСКК (П) № 2351) и характеризуется следующими признаками.

Культуральные признаки. Стандартные условия выращивания. Среда ДМЕМ+ + 10% фетальной сыворотки крупного рогатого скота (Fes) температура при культивировании 37 С, газовая фаза - ,воздух +5% CO.J, Способ культивирова- ния - в пластиковых флаконах на 50- 250 мл, посевная доза 500.000 клеток/мл, кратность рассева 1:2, время субкультивирования 3-4 дня.

В организме животного - мышь BALB/ обработанная приставом (0,5 мл в/бр. за 5-40 дней до инокуляции), доза инокуляции 3-8 млн клеток, время образования асцита 10-20 дней.

Характеристика продуцируемого продукта. Штамм гибридных клеток продуцирует монАТ IgG класса, направленны рротив.Л-ХГЧ, оН1Г, -ФСГ и человека. Концентрация полезного продукта (монАТ против of-ХГЧ. с/-ЛГ, - #-ФСГ и оРГТГ человека) в культураль ной среде около 10 мкл/мл, в асцити- ческой жидкости - около 7 мг/мл, титры данных антител при определении с помощью твердофазного иммунофермент- ного метода 1:3000 в культуральной Среде, 2x10 - в асцитической жидкое ти, при концентрации антигена при нанесении на пластинки 30 ед/мл офици- нального препарата ХГЧ.

Определение антител проводят имму лофлуоресцентными и радиоиммунологическими методами. Продукция монАТ стабильна по крайней мере в течение 35 пассажей ин витро и 15 пассажей на животных, если гибридома перевивается на мышах о Контаминации бактериями и грибами нет, микоплаз- мы не выявлены.

0

5

0

5

0

5

0

5

Способ криоконсервации. 4x1 Ofc клеток в ДМЕМ+10% DMSO, замораживание в пенопластовой коробке , при -70 С, жизнеспособность клеток после размораживания 70-90% (оценка жизнеспособности по исключению клетками трипанового синего после 24 ч культивирования),

.Пример 1. При использовании гибридомы получены специфические к Л-ХГЧ, rf-ЛГ, #-ФСГ и Л-ТТГ человека монАТ путем выделения их из асцитической жидкости мыши. Из 1 мл асцитической жидкости с помощью высаливания сульфатом аммония с последующей ионообменной хроматографией на клонках с ДЕАЕ-52 целлюлозой выделяют 7,5 мг монАТ к анти- (/-ХГЧ, of-ЛГ, ofr-ФСГ и С/-ТТГ человека.

Контроль на специфичность монАТ проводят в системе твердофазного им- муноферментного анализа. МонАТ реагируют с of-ХГЧ, цельной молекулой ХГЧ (официальный препарат J, ЛТ, ФСГ и ТТГ человека, не реагируют с ЛГ свиньи, коровы, лошади, ФСГ-свиньи и коровы и ХГ-лошади. I

Пример 2. Продуцируемые штаммом монАТ используют для разработки твердофазной системы иммуно- ферментного анализа для определения ХГЧ и ЛГЧ в биологических жидкостях организма. На пластинках адсорбируют монАТ против р-ХГЧ или Ј-ЛГЧ „ (10 мкг/мл), инкубируют при 4°С в течение 12-17 ч. Отмывают несвязавшиеся с пластиком монАТ буфером PBS 3 pasaj инкубируют пластинки при комнатной температуре в течение 1 ч, повторно отмывают 3 раза буфером PBS с твином-20 (0,5 мл на 1 л - 0,05%). Добавляют исследуемую пробу биологической жидкости (сыворотка крови, моча). Инкубируют 1 ч при 37°С, отмывают 3 раза смесью PBS - твин-20, добавляют конъюгированные с пероксида- зой монАТ (концентрация 4 мг/мл) в рабочем разведении (1:1600) в PBS - твин-20. Инкубируют 1 ч при 37°С, отмывают 5 раз смесью PBS - твин-20 и 3 раза холодной водопроводной водой, добавляют субстрат, 4 мкл 33%- Н202на 20 мин при комнатной температуре. Останавливают реакцию добав- лением 10%-ного раствора H2S04 и учитывают результат путем измерения оптической плотности при 492 нм.

5 1555360

Использование штамма гибридомы -Формула изобретения

позволяет получать монАТ, реагирую- (Штамм гибридных культивируемых

щие с ХГЧ, ЛГЧ, ФСГЧ и ТТГЧ в разветклеток животных Mus.musculus BCKK

дении 1 мкг/мл и проводить определе-.(П) # 235DT используемый для получе-Vния уровня гонадотропных гормонов в ния моноклокальных антител к о -субъбиологических жидкостях организма сединице гонадотропных гормонов чепомощью иммунологических методов.ловека.

Изобретение относится к гибридомной технологии и может быть использовано для иммунологического определения уровня гонадотропных гормонов в биологических жидкостях организма. Цель изобретения - получение штамма гибридных культивируемых клеток, продуцирующих моноклонольные антитела, специфичные к α-хорионическому, α-лютеинизирующему, α-фолликулостимулирующему и α-тиреотропному гонадотропинам человека. Штамм получен путем гибридизации клеток мышиной миеломной линии Х.63.AG8.653 с клетками селезенки мыши BALB/с, иммунизированной хорионическим гонадотропином человека. Штамм депонирован под номером ВСКК (П) N 235Д. Продуцирует моноклональные антитела JGG класса в количестве 10 мкг/мл культуральной среды и 7 мг/мл асцитической жидкости, титры антител 1:3000 и 2^.10⁵ соответственно, определенные в твердофазном ИФА.