Штамм гибридных культивируемых клеток животных MUS.мUSсULUS-продуцент моноклональных антител, специфичных к @ -хорионическому гонадотропину человека и @ -лютеинизирующему гормону человека, свиньи и коровы Советский патент 1990 года по МПК C12N5/00 A61K39/395 

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для - определения хорионического гонадотро- пина человека (ХГЧ), лютеинизирующе- го гормона человека (ЛГЧ) лютеини- зирующего гормона свиньи (ЛГС) и лю- теинизирующего гормона коровы (ЛГК).

Целью изобретения является получение штамма гибридных культивируемых клеток животных Mus, musculus , продуцирующего моноклональные антитела (монАТ), специфичные к /1-ХГЧ, /i-ЛГЧ, /i-ЛГС, /i-ЛГК.

Штамм получают следующим образом.

В качестве антигена использован официальный препарат хорионического гонадотропина человека (ХГЧ), выпускаемый Московским Эндокринным заводом. Мышей линии BALB/c иммунизируют внутрибрюшинно по следующей схеме: в 1-й день - 500 ед. препарата в смеси с полным адъювантом Фрейнда (ПАФ) на 14 и 28-й день вводят по 250 ед, препарата с ПАФ, реиммуннзируют мыелел

СП

03 О)

шей на 56-й день - 2500 ед. препарата ХГЧ в забуференном физиологическом растворе хлорида натрия. Через 72-96 ч после реиммунизации у мыши стерильно удаляют селезенку и готовят суспензию спленоцитов. Клетки селезенки мыши BALB/c, иммунизированной препаратом ХГЧ, сливают с клет- ками мышиной миеломы Х63, До 8.653. Сливающий агент ПЭГ-1500 (50% раствор).

Селекцию проводят на среде HAT, два клонирования методом лимитирующего разведения (1 клетка на 3 лунки) ,100% позитивных клонов.

Полученный штамм гибридных клеток обозначен D38. Штамм хранится в Специализированной коллекции перевиваемых соматических клеток позвоночных Института цитологии АН СССР под номером ВСКК(П) № 236D и характеризуется следующими признаками.

Культуральные признаки. Стандартные условия выращивания - среда SPMI фетальной сыворотки крови крупного рогатого скота (FCS), температура при культивировании 37°С, газовая фаза - воздух + 5% COj.

Способ культивирования в пластиковых флаконах на 50-250 мл, посев- |ная доза 500000 клеток/мл, кратность рассева 1:2, время, субкультивирования 3-4 дняо

Культивирование в организме животного В организме животного -мышь BALB/c, обработанная приставом (0,5 мл в/бр. за 5-40 дней до инокуляции), доза инокуляции 3-8 млн.клеток, время образования асцита 10- 20 дней

Продуктивность штамма. Концентрация полезного продукта (монАТ против р-ХГЧ, ji-ЛГЧ, р-ЛГС, р-ЛГК) в культуральной среде около 10 мкг/мл, в асцитической жидкости - около 7 мг/мл.

Титры данных антител при определении с помощью твердофазного иммуно ферментного метода: 1:3000 - в куль туральной среде, 2x10 - в асцитичес кой жидкости, при концентрации антигена при нанесении в лунки пластинки 30 ед/мл официального препарата ХГЧ Московского эндокринного завода. . Характеристика полученного продук та. Гибридома секретирует монАТ против ХГЧ, ЛГЧ, ЛГС и ЛТК, определяемые иммуноблоттингом, иммунофермента10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

ми, иммунофлуоресцентными и радиоиммунными методами. Штамм продуцирует монАТ IgG класса. Продукция монАТ стабильна в течение 30 пассажей ин витро и 15 пассажей на животных, если гибридома перевивается на мышах с

Криоконсервирование, Для длительного хранения клетки штамма в количестве 4x10 в эмбриональной телячьей сыворотке с добавлением 10% диметилсульфоксида замораживают в пенопластиковой коробке при -70°С. Жизнеспособность клеток после размораживания 70-90% по окрашиванию три- пановым синиле.

Контаминация , Контаминация бактериями и грибами нет, микоплазмы не выявлены.

Пример 1. При использовании гибридомы получают специфические к /5-ХГЧ, /i -ЛГЧ, ft-ЛГС иЈ-ЛГК монАТ IgG класса путем выделения их из асцитической жидкости мыши. Из 1 мл асцитической жидкости мыши с помощью высаливания сульфатом аммония с последующей ионообменной хроматографией на колонках с ДЕАЕ-52 целлюло- зой выделяют 8,5 мг монАТ. Контроль на специфичность монАТ проведен в системе твердофазного иммунофермент- ного анализа.

Полученные монАТ реагируют с /3-ХГЧ, ХГЧ, ЛГЧ, ЛГС и ЛТК, не реагируют с ФСГ и ТТГ человека, ФСГ свиньи и коровы иХГ-лошади.

Пример 2. Продуцируемые штаммом монАТ используют для разработки твердофазной системы конкурентного радиоиммунологического анализа, в которой монАТ фиксировались на полистероловых пробирках. Чувствительность системы 5 мМЕ/мл ХГЧ, коэффициент вариации в серии образцов 3%,

При исследовании мочи больных хо- рионэпителиомой выявлена корреляция с концентрацией ХГЧ в сыворотке крови и с клиническим течением заболевания.

Пример 3. Продуцируемые штаммом монАТ используют для разработки тест-системы иммунофлуоресцентного анализа ХГЧ в моче женщин с целью диагностики раннего срока беременности.

В тест-системе используют твердофазный диагностикум, представляющий /

собой зерна цианогенбромированной агарозы, на которых конъюгированы монАТ, продуцируемые, штаммом. Факт связывания ХГЧ с диагяостикумом выяв ляют с помощью 2-антител - кроличьих моноспецифических антител к ХГЧ, конъюгированных с ФИТЦ. В случае положительной реакции наблюдают яркое краевое свечение зерен диагностикума в люминесцентном микроскопе.

С помощью тест-системы проведено более 150 определении ДГЧ в моче женщин с ранними сроками беременности показавших хорошую корреляцию

10

15

с последующей клинической диагностикой беременности у обследованных жен щин. Чувствительность тест-системы 1 ME/мл. Точность диагностики беременности в сроки 2-4 недели 100%.

Формула иэйбретення

Штамм гибридных культивируемых клеток животных Mue.muaculus ВСКК(П) № 236D - продуцент моноклоналъных ан- тител, специфичных к уэ-хорионическо- му гонадотропину человеке и р-лютеини- зирующему гормону человека, свиньи и

коровы.

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для определения хорионического гонадотропина человека (ХГЧ), лютеинизирующего гормона человека (ЛГЧ), свиньи (ЛГС) и коровы (ЛГК). Целью изобретения является получение штамма гибридных культивируемых клеток животных MUS MUSCULUS, продуцирующего моноклональные антитела (монАТ), специфичные в β-ХГЧ, β-ЛГЧ, β-ЛГС и β-ЛГК. Штамм получают гибридизацией силеноцитов мышей, линии BALB/с, иммунизированных препаратом ХГЧ с клетками мышиной миеломы Х63.Ад8.653. Штамм депонирован под номером ВСКК(П) N236Д. КЛЕТКИ КУЛЬТИВИРУЮТ В СРЕДЕ RPM 1-1640 с 10%-ной донорской телячьей сывороткой при 37°С в атмосфере 5% CO₂. Клетки пассируют один раз в 3 - 4 дня, кратность рассева 1:2. Секреция монАТ составляет в культуральной среде @ 10 мкг/мл и в асцитической жидкости @ 7 мг/мл. МонАТ относятся к 1GG классу и специфически взаимодействуют с β-ХГЧ, β-ЛГЧ, β-ЛГС, β-ЛГТ. МонАТ могут быть использованы в диагностических целях.