Штамм гибридных культивируемых клеток животных MUS мUSсULUS L, используемый для получения моноклональных антител к антигену СД38 кортикальных тимоцитов Советский патент 1990 года по МПК C12N5/00 A61K39/395 

Изобретение относится к гибридом- ной технологии и может быть использовано для определеш1я иммунологического статуса организма.

Цепь изобретения - получение моно- клональных антител, выявляющих новый эпитоп молекулыCD38, сильно экспрес- сированный на мононуклеарных клетках крови и гранулоцитах.

Штамм получают следующим образом.

Проводят соматическую гибридизацию клеток мышиной миеломы РЗ бЗ-Ag 8653 и слеток селезенки мышей линии BALB/C, иммунизированных Т-лймфоци- , тами человека, выделенные по методу Е-розеткообразования. Проводят пять Инъекций с интервалами в две неДели. К летки в количестве ЛхЮ вводят в.

хвостовую вену мьпии. На пятый день после последней иммунизации проводят слияние клеток селезенки мыши и мышиной миеломы Ag 8653. В стерильных условиях извлекают селезенку иммунизированной мьшга и измельчают ножницами, э затем в гомогенизаторе Поттера. Взвесь клеток фильтруют через два слоя марли. Лимфоциты дважды отмывают средой 199 и сливают с клетками миеломы в соотношении 10:1. Смесь клеток отмывают один раз и помещают в объеме 20 мл среды 199 во флакон объемом 100 мл. В этом фпа- коне клетки центрифугируют 800 об/мин в течение 3 ь«н и инкубируют 20 мин при 37°С. Среду осторожно насухо отсасывают и к клеткам добавлясл

QD СП

дэ

ю

ют 3 мл 30%-ного полиэтиленгликоля с мол.м, 1500. Через 90 с во флакон вносят 20 МП среды 199, Клетки три раза отмывают, не встряхивая, и инкубируют при ЗУ С в течение 2 ч в 20 мл среды роста (DMEM), содержащей 20% телячьей эмбриональной сыворотки, 2 мМ/мл глютамина и 0,1 мг/мл гента- мйцина. Затем рслетки разливают по 0,2 МП в лунки 96 - луночного плато, ; На следующий день среду меняют на срецу ГАТ (среда роста, содержащая 0,0136 мг/мл гипоксантина} 0,00091 мг/м

Культивирование in vitro. Для выращивания штамма используют пластиковую или стеклянную посуду. Во флакон объемом 45 см в 5 мл среды заливают по 510 клеток штамма. Пассаж 1 раз в 3-4 дня той же дозой, Штамм выращивают при на среде КРЖ-1640 или среде MEM в IX модификации Дульбекко, содержащей 15,0% оленьей или телячьей эмбриональной сыворотки; 2 мМ/мл глютамина; 0,1 мг/мл гентамицина.

Культивирование in vivo,-Для выращивания опухоли из штамма гибридных

Изобретение относится к гибридомной технологии и может быть использовано для определения иммунологического статуса организма. Цель изобретения - получение моноклональных антител, выявляющих новый эпитоп молекулы CD 38, сильно экспрессированный на мононуклеарных клетках крови и гранулоцитах. Штамм получают путем гибридизации клеток мышиной миеломы РЗ х 63 AG 8653 и клеток селезенки мышей линии BALB/C, иммунизированных Т-лимфоцитами человека и отбором клонов, продуцирующих монАТ. Штамм ИКО-45 депонирован под номером ВСКК(II) N 314D и продуцирует монАТ, относящиеся к IG 3 классу. Титр антител в культуральной жидкости 1:50, в асцитической жидкости 1:100000. МонАТ выявляют новый эпитоп антигена CD 38 с мол.м. 45 тыс. дальтон.

аминоптерина; 0,00385 мг/мл тимидина),}5 клеток пригодны мьшги самки линии

BALB/C, -Интактным мьш1ам за 1-7 дней до прививки опухоли вводят внутри- брюшинно (в/бр) по 0,5 мл вазелиново го масла. Клетки гибридомы вводят 2Q в/бр по 10 клеток на мьш1ь в 4 мл ср ды. Через 7-10 дней у мьшей возник аю асцитные опухоли. Культуру клеток гибридомы поддерживают серийными пас сажами асцитной опухсиш,

Видимые колонии появляются на две- н||дцатый день в 95 из 96 лунок, скрининг проводят в непрямой реакции поверхностной иммунофлюоресценции. При обнаружении специфического свечения проверяют реакцию антител с дру- |ГЯми клетками крови доноров. После тестирования продуцирующие гибридог ы клонируют методом органических разведений на фидере из клеток селезенки и тимуса мыши в линии BALB/c,

Для приготовления фидера тимус и селезенку разрушают в стеклянном гомогенизаторе ПотТера, Взвесь клеток

фильтруют через марлевый фильтр, Клет- Q CD38 с мол,м, 45000 дальтон, Специки разливают в среде роста по 0,1 мл в лунки 96-луночного плоскодонного плато. Через 1-7 дней плато используют как {|идер. При клош1ровании клетки из продуцирующей лунки снимают нежным пипетированием. Количество клеток подсчитывают в камере Горяева и разводят в среде до конечной концентрации 50 клеток в 10 мл среды роста. Клетки разливают по О,1 мл в лунки на фидер. При этом на две лунки приходится одна клетка.

После первого клонирования клоны пябридных клеток появляются на четырнадцатый день в 25 из 96 лунок, Про- водят тестирование гибридом на Т-клет- ки человека и из положительной лун- км гибридому вновь клонируют. Колонки возникают на двенадцатый день в 58 из 96 лунок. Проводят скрининг на Т-клетках, Позитивные клоны после к.(1онирования составл:яют 100% (58 из 58),

ПолученньпЧ штамм обозначен ИКО-45. Штамм гибридных клеток депонирован под номером BCKK(II) № 3 UD и характеризуется следующи1Ж признаками,

Культуралыше свойства.

35

40

45

50

фичность моноклональных антител опре деляют в непрямой реакции поверхност ной иммунофпюоресценции по стандартной методике, Титр антител в культу- ральной жидкости 1:50, титр антител в асцитической жидкости 1:100000, Срок хранения моноклональных антител при минус 1 год. Стабильность продуциров ания антител сохраняется н протяжении 25 пассажей ин витро, 15 пассажей ин виво.

Криоконсервирование.

Клетки штамма ресуспендируют в среде RPMI 1640, содержащей 20% телячьей эмбриональной сыворотки, к су пензии клеток добавляют 10% диметил- сульфоксида (ДМСО) до конечной кон- центр.ации 10%, Количество клеток на 1 ампулу объемом 1 мл составляет 10- -20x10 , Замораживание проводят при

-70 С в течение 2

ч, 3 ат ем ампулы с -

55

клетками помещают в Ж1 сдкий азот, Раз моражива1ше проводят при в тече ние 70 с. Ампулы с клетками центрифу гируют при 1500 об/мин 2 мин. Затем клетки, находящиеся в осадке, перено сят во флакон объемом 45 см, содержащий 7 мл среды RPMI 1640 с 15% телячьей эмбриональной сыворотки.

клеток пригодны мьшги самки линии

BALB/C, -Интактным мьш1ам за 1-7 дней до прививки опухоли вводят внутри- брюшинно (в/бр) по 0,5 мл вазелинового масла. Клетки гибридомы вводят в/бр по 10 клеток на мьш1ь в 4 мл среды. Через 7-10 дней у мьшей возник ают асцитные опухоли. Культуру клеток гибридомы поддерживают серийными пассажами асцитной опухсиш,

Характеристика полезного продукта,

Гибридома продуцирует монокпональ- ныё антитела IgG 3 класса, Специфич- -ность - моноклональные антитела ШКО-45 выявляют новый эпитоп антигена

CD38 с мол,м, 45000 дальтон, Специ

фичность моноклональных антител определяют в непрямой реакции поверхностной иммунофпюоресценции по стандартной методике, Титр антител в культу- ральной жидкости 1:50, титр антител в асцитической жидкости 1:100000, Срок хранения моноклональных антител при минус 1 год. Стабильность продуциров ания антител сохраняется на протяжении 25 пассажей ин витро, 15 пассажей ин виво.

Криоконсервирование.

Клетки штамма ресуспендируют в среде RPMI 1640, содержащей 20% телячьей эмбриональной сыворотки, к суспензии клеток добавляют 10% диметил- сульфоксида (ДМСО) до конечной кон- центр.ации 10%, Количество клеток на 1 ампулу объемом 1 мл составляет 10- -20x10 , Замораживание проводят при

-70 С в течение 2

ч, 3 ат ем ампулы с -

клетками помещают в Ж1 сдкий азот, Раз- моражива1ше проводят при в течение 70 с. Ампулы с клетками центрифугируют при 1500 об/мин 2 мин. Затем клетки, находящиеся в осадке, переносят во флакон объемом 45 см, содержащий 7 мл среды RPMI 1640 с 15% телячьей эмбриональной сыворотки.

51595902

2 мМ/мл глютамина 0,1 мг/мл гентамицина. Жизнеспособность клеток после размораживания по включению трипано- вого синего составляет 6Cf%.

Контаминация,

Бактерии и грибок при длительном культивировании и посевах на гшта- телЬные среды в культиваторе не обнаружены. Заражение микоплазмой не выявлено.

Использование моноклональных антител (монАТ), продуцируекых гибридо- мой, иллюстрируется следующими примерами,.

Пример 1, Использование моноклональных антител ИКО-45 для определения иммунологического статуса у бальных раком молочной железы.

Содержание ИКО-45 положительных клеток в крови исследовано у 14 больных раком молочной железы II-III степени. Было обнаружено, что у 10 из 14 бальных процент ИКО-45 положительных клеток статистически значимо снижен по сравнению с контролем - 29,3+3,9 и 50,3+12,5 соответственно, , Через 1-3 недели после операции -процент ИКО-45 положительных клеток не

П р и м е р 2. Использование моноклональных антител ИКО-45 для определения иммунологического статуса у , доноров крови.

Обследовано 12 доноров крови. Обнаружено, что у доноров крови процент ЖО-45 положительных клеток колеблется от 35 до 70%. У одного донора кро- 10 ви процент ИКО-45 положительных кле- : ток резко снижен (20%). Применение других монАТ (ОКТ4, ОКТ8, ОКТЗ, ИКО-1 1) подтвердило состояние иммунитета у зтого донора.

Таким образом, по проценту ИКО-45 положи тел клеток можно судить о . состоянии иммунной систекы человека,

МонАТ ИКО-45, полученные с помощью гибридомы, определяют антиген на одноядерных клетках крови, по процентному содержанию которых можно судить о состоянии иммунной системы организма,

) Преимущество использования монокло- 25 нальных антител ИКО-45 по сравнению. с прототипом ИКО-20 состоит в том, на люминесцентном жкроскопе ИКО-45 определяют в норме 50% антйтел-по15

20

свидетельствующие о состоянии иммунной системы организма.

.-,., „ :ложительных клеток, а ИКО-20 - 5%

изменился. Однако через 3-4 мес после 30 Это позволяет за4иксировать измене- операции количество ИКО-45 положи-ния антиген-папожительных клеток

тельных клеток возвратилось к норме,

Параллельное использование других монАТ, рутинно используемых для определения иммунологического статуса (ОКТ4, ОКТ8, ИКО-П), подтвердило им- мунодепрессивное состояние у этих б ольных до лечения и через 1-3 нед

после операции и восстановление пока-, ,....,, .. .,„, „.„.„..н д. по- .затепей иммунитета 3j-4 мес пос- 40 лучения моноклональных антител к анти- ле операции,гену CD38 кортикальных тимоцитов.

35

Формула из

обретения

Штамм гибридных культивируемих клеток животных Mus musculus L. |BCKK(II) № 3I4D, используем гй для поП р и м е р 2. Использование моноклональных антител ИКО-45 для определения иммунологического статуса у , доноров крови.

Обследовано 12 доноров крови. Обнаружено, что у доноров крови процент ЖО-45 положительных клеток колеблется от 35 до 70%. У одного донора кро- 0 ви процент ИКО-45 положительных кле- : ток резко снижен (20%). Применение других монАТ (ОКТ4, ОКТ8, ОКТЗ, ИКО-1 1) подтвердило состояние иммунитета у зтого донора.

Таким образом, по проценту ИКО-45 положи тел клеток можно судить о . состоянии иммунной систекы человека,

МонАТ ИКО-45, полученные с помощью гибридомы, определяют антиген на одноядерных клетках крови, по процентному содержанию которых можно судить о состоянии иммунной системы организма,

) Преимущество использования монокло- 5 нальных антител ИКО-45 по сравнению. с прототипом ИКО-20 состоит в том, на люминесцентном жкроскопе ИКО-45 определяют в норме 50% антйтел-по5

0

свидетельствующие о состоянии иммунной системы организма.

Это позволяет за4иксировать измене- ния антиген-папожительных клеток

35

Формула из

обретения

,....,, .. .,„, „.„.„..н д. по- лучения моноклональных антител к анти- гену CD38 кортикальных тимоцитов.

Штамм гибридных культивируемих клеток животных Mus musculus L. |BCKK(II) № 3I4D, используем гй для по