Способ обнаружения клофелина в биологических жидкостях Советский патент 1992 года по МПК G01N33/50 

Изобретение относится к области медицины, а именно к способам обнаружения клофелина (гемитона, катапресана, клони- дина), и может быть использовано при токсикологических, биофармацевтических и фармакокинематических исследованиях в условиях клинических лабораторий

Целью изобретения является повышение чувствительности, селективности и снижения токсичности способа обнаружения клофелина в биологических жидкостях (кровь, моча).

П р и м е р 1. Исследование крови (модельный опыт)

10 мл крови, содержащей 1000 мкг клофелина, после инкубирования в течение 24 ч при комнатной температуре смешивают с 25 мл воды и оставляют для гемолиза на 20 мин. После добавления по каплям при перемешивании 9 мл 20%-ного раствора трихлоруксусной кислоты раствор нагревают на кипящей водяной бане в течение 1 ч в колбе с обратным холодиль

ником или 30 мин на глицериновой бане (140 + 5°С). После охлаждения гидролизат центрифугируют при 5000 об/мин 5 мин и надосадочную жидкость сливают в колбу. Осадок трижды промывают 10 мл раствора хлороводородной кислоты (5 мл конц. уд. вес. 1,19 + 95 мл воды) с последующим центрифугированием. Надосадочные жидкости объединяют, подщелачивают до рН 9-10 25%-ным раствором гидроксида аммония и экстрагируют хлороформом (25 мл х 3) в течение 20 мин. Образующуюся эмульсию разрушают центрифугированием при 5000 об/мин. Экстракты отделяют, хлороформ испаряют при комнатной температуре до остаточного объема 2 мл.

На полоску хроматографической бумаги марки М (15 х 29 см) наносят по 0,02 мл растворов экстрактов модели крови, контроля крови (извлечение соэкстрактивных ве- ществ проводят из 10 мл крови по описанной методике), раствора свидетеля содержащего 10 мкг клофелина. Диаметр

со

с

VI

4 О CJ

начального пятна 0,3-0,5 см, расстояние между точками нанесения 2 см Электрофорез проводят в течение 1 ч при напряжении 400 В, в модифицированных камерах к прибору ПЭФ-3. Начальная температура электролита 20°С.

Электролит- универсальный буферный раствор Бриттона-Робинсона рН 1,8. Элект рофореграммы(ЭФГ) высушивают на воздухе и обрабатывают последовательно модифицированным реактивом Драгендор- фа по Бертгоффу-Дельвиче и раствором хлороводородной кислоты с рН 2,0-2,5. Обнаружение окрашенных в темно-серый цвет зон клофелина на светло-сером фоне проводят по длине пути фореза (ДПФсм) - расстояние от линии старта до переднего края зоны, в сравнении с ДПФсм свидетеля. Чувствительность реакции обнаружения клофелина 0,3-0,5 м/г в пробе. При обработке ЭФ Г по данной Методике обнаруженные зоны клофелина, содержащие 10 мкг и более, имеют темно-серый цвет с красноватым оттенком,интенсивность которого зависит от концентрации препарата. Предел обнаружения составляет 50 мкг клофелина на 10 мл объекта.

П р и м е р 2. Исследование мочи (модельный опыт).

199 мл мочи, содержащей 1000 мкг клофелина, после 24 ч инкубирования при комнатной температуре подкисляют до рН 1,0 концентрированной хлороводородной кислотой и нагревают на кипящей водяной бане в течение 1 ч в колбе с обратным холодильником или 30 мин на глицериновой бане (140-5°С). После охлаждения гидролизэт подщелачивают до рН 9-10 25%-ным раствором гидроксида аммония и экстрагируют хлороформом (40 мл х 3) в течение 20 мин. Образующуюся эмульсию разрушают центрифугированием при 5000 об/мин 5 мин. Экстракты отделяют, хлороформ испаряют при комнатной температуре до остаточного обьема 2 мл. Очистку хлороформного экстракта мочи и обнаружение зон клофёлина проводят электрофорезом на бумаге по методике, описанной в примере 1. Для нанесе- ния на ЭФГ используют по 0,02 мл растворов мидели мочи, контроля мочи (извлечение соэкстрактивных веществ проводят из 100 мл мочи по описанной методике), раствора свидетеля, содержащего 10 мкг клофелина. Предел обнаружения составляет 50 мкг клофелина на 100 мл объекта

П р и м е р 3. Исследование мочи (клинический материал).

100 мл мочи больного Н, принимавшего в течение 18 сут клофелин в терапевтических дозах (0,075 мг х 3) в сочетании с коринфаром, феназепамом, анаприлином, цинна- ризином, подкисляют до рН 1,0 концентрированной хлороводородной кислотой и нагревают на глицериновой бане (140 + 5°С)

в колбе с обратным холодильником. После охлаждения гидролизат подщелачивают до рН 9-10 25%-ным раствором гидроксида аммония и экстрагируют хлороформом в течение 20 мин (10 мл х 3). Образующуюся

0 эмульсию разрушают центрифугированием при 5000 об/мин 5 мин. Экстракты отделяют, хлороформ испаряют при комнатной температуре до остаточного объема 2 мл, Параллельно по данной методике были пол5 учены экстракты из мочи: модельный опыт (1000 мкг клофелина в 100 мл мочи, контрольный опыт 100 мл мочи больного Н до приема клофелина.

На линию старта полосы хроматогра0 фической бумаги марки М (15 х 29 см) наносят в три отдельные точки по 0,05 мл растворов экстрактов: модели мочи, контроля мочи и мочи больного. В четвертую точку наносят свидетель - клофелин, в

5 пятую: клофелин и смесь веществ, сопутствующей терапии (коринфар, феназепам, анаприлин, циннаризин). Диаметр начального пятна 0,3-0,5 см, расстояние от края ЭФГ не менее 1.5 см, расстояние

0 точками нанесения 2 см. Электрофорез проводят при избранных условиях (пример 1) ЭФГ высушивают на воздухе. В УФ-свете отмечают локализацию зол веществ, обладающих свечением. По характеру свечения

5 (коринфар желто-зеленого, феназепам желтое, анаприлин фиолетовое, циннаризин светло-фиолетовое) и ДПФсм , проводят идентификацию этих веществ. При значении рН электролита 1,8 клофелин в УФ-све0 те не флюресцирует. После обработки модифицированным реактивом Драгендор- фа по Бертгоффу-Дельвиче тотчас обрабатывают раствором хлороводородной кислоты с рН 2,0-2,5 до перехода оранжево5 го окрашивания фона в светло-серое, зона клофелина при этом окрашивается в темно- серый цвет,

Идентификацию окрашенных зон исследуемых веществ проводят по ДПФсм Ха0 рактер окрашивания и ДПФсм клофелина - свидетеля и клофелина, выделенного из мочи больного, идентичны и равна 9,7 см. При исследовании клинического материала (моча) было установлено, что обнаружению

5 и идентификации клофелина не мешают также вещества, назначаемые совместно с ним: триампур, агапурин. фентоламина гидрохлорид, курантил.

Изучено влияние рН раствора хлороводородной кислоты на характер окрашивания зоны и фона Установлено, что при значении рН от 2,0 до 2,5 данная реакция обна- ружения обладает максимальной чувствительностью.

Обнаружение клофелина при данной чувствительности возможно при использовании хлороводородной, азотной и серной кислот и невозможно в присутствии фосфорной и уксусной. Выбор в качестве детектирующего реагента хлороводородной кислоты обусловлен ее доступностью и меньшей токсичностью.

Таким образом, предлагаемый способ обнаружения клофелина в биологических жидкостях высокочувствителен, нетокси- чен, селективен, так как позволяет дифференцировать препарат в присутствии лекарственных веществ сопутствующей терапии. Кроме того, предлагаемый способ позволяет повысить чувствительность реакции по сравнению с известным способом (в известном чувствительность реакции 10-15 мкг, в предлагаемом 0,3-0,4 мкг в пробе).

Формула изобретения Способ обнаружения клофелина в биологических жидкостях путем изолирования подкисленной водой, проведения гидролиза, экстракцию органическим растворителем с последующим разделением компонентов пробы и обнаружением кло- фелина после обработки реактивом Дра- гендорфа по Бертгоффу-Дельвиче, отличающийся тем, что, с целью повышения чувствительности, специфичности и снижения токсичности способа, разделение компонентов пробы проводят электрофорезом на бумаге с последующей обработкой элек- трофорограммы реактивом и раствором хлороводородной кислоты с рН 2,0-2,5 и обнаружением клофелина по длине пути фо- реза.

Использование: в медицине, при токсикологических, биофармацевтических и фармакокинетических исследованиях в клинических лабораториях. Цель - повышение чувствительности, специфичности и снижение токсичности способа. Пробу крови или мочи подвергают электрофорезу на бумаге с последующей обработкой электрофорег- раммы реактивом и раствором хлороводородной кислоты с рЙ 2,0-2,5 и обнаружением клофелина подлине пути фо- реза. Использование изобретения позволяет повысить чувствительность реакции примерно в 3-4 раза и идентифицировать клофелин в присутствии других лекарственных веществ сопутствующей терапии.