Способ определения диклофенака натрия в биологической жидкости Советский патент 1989 года по МПК G01N33/48 

Изобретение относится к области медицины, а именно к биологическим методам исследования, и может быть использовано для определения количества вольтарена в биологических жидкостях или лекарственных формах.

Цель изобретения - повышение чув- ствительности способа.

Постоянная цель достигается тем, что используется цветная реакция вольтарена с пероксидом водорода и пероксидазой при рН инкубационной среды в интервале 7,2-7,7.

На чертеже приведена калибровочная кривая для определения вольтарена.

Способ осуществляется следующим образом.

К пробе, содержащей вольтарен, прибавляют 0,1 моль калий-фосфатный буфер с рН 7,2-7,7 раствор перокси- дазы до конечной активности 4-10 ед.

на 3 мл пробы, раствор пероксидаза водорода до конечной концентрации 0,49-1,96 мкмоль/3 мл пробы, а оптическую плотность окрашенного продукта измеряют в интервале. 30-60 MiiH при 450-460 нм.

Максимальный выход окрашенного продукта наблюдается при рН инкубационной среды в интервале 7,2-7,7, в промежутке 30-60 мин после прибавления реактивов (табл.1.).

Максимальная плотность окрашенного продукта наблюдается при концентрации пероксидазы в пробе в интервале 4-10 ед активности на 3 мл. Зависимость оптической плотности окрашенного продукта от концентрации пероксидазы в пробе приведена в табл.2. В работе использован известный препарат пероксидазы из хрена с исходной активностью 650 ед/мг. Непосред4; |.

со

ственно перед использованием проверяли активность препарата по методу Симакова. Обесцвечивание индигокар- мина определяли спектрофотометрически за 1 мин. Сухой препарат перокси-- дазы растворяли в дистиллированной воде до концентрации 20-120 ед. активности (мкмоль обесцвеченного инди гокармина/мин) в 1 мл.

Максимальная оптическая плотность окрашенного продукта наблюдается нри кбщентрации нероксида водорода в интервале 0,49-1,96 мкмоль/3 мл пробы. В табл. 3 приведена зависимость оптической плотности окрапгенного продукта от количества пероксид.а водорода в пробе.

Максимум поглощения окрашенного продукта находится в интервале 450- 460 нм (табл.4). Это свидетельствует что в результате реакции пероксида водорода и пероксидазы образуется с вольтареном качественно отличньм комплекс по сравнению с известным. Максимум поглощения окрашенного продукта взаимодействия вольтарена с пе рийодатом натрия находится при 550 нм

Проведено экснериментальное сравнение чувствительности предлагаемого способа.определения вольтарена с таковой у. известного. Оказалось, что чувствительность предлагаемого способа примерно в 10 раз превосходит таковую в известном (табл.5). Линейная зависимость между количеством вольтарена и величиной оптической плотности, как видно из табл,5 и черте жа, сохраняется в интервале 0,5 - 30 мкг.

Воспроизводимость способа была проверена на пяти параллельных определениях (табл.6). Коэффициент.вариации составляет 2,24%.

I.

Специфичность способа определения

вольтарена была проверена на препаратах, назначение которых совместно с вольтареном наиболее вероятно (табл.7). Оказалось, что анальгин, индометацин, аспирин, эуфиллин не дают окрашенного продукта в условиях определения вольтарена.мидопирин в эти условиях дает слабо окрашенный продукт с другим максимумом поглощения (580 1м), который к тому же исчезает в течение 10-15 мин.

0

5

0

5

0

5

0

5

0

5

Возможность определения вольтарена в лекарственных формах была проведена на инъекционном препарате вольтарена производства фирмы Плива (Югославия) в сотрудничестве с фирмой Сиба-Гейги. Оказалось, что содержание вольтарена в препарате, определенное предлагаемым способом, составляет 73,8 мг в 3 мл, что практически совпадает с концентрацией вольтарена, указанной в рецептуре - 75 мг/3 мл.

Возмолсность определения вольтарена в биологических жидкостях бьша проверена на плазме крови и моче, к которым были добавлены различные количества вольтарена. Опыты показали, что прямое определение вольтарена в биологических жидкостях невозможно, так как после добавления реактивов окраска не:развивается. Для определения вольтарена в биологических жидкостях необходима предварительная экстракция .

Вольтарен из плазмы крови и мочи экстрагировали органическими растворителями из подкислен1Л;1х проб. В качестве растворителя использован хло- роформ. Для подкисления проб использовали 2,5 н. раствор фосфорной кислоты. Для оценки полноты экстракции .вольтарена из биологических жидкостей были проведены опыты. Использо- ванный способ экстракции обеспечивает практически полное извлечение вольтарена, добавленного к пробам плазмы крови и мочи (табл.8).

С целью проверки специфичности способа -экстракции экстрагировали также пробы плазмы крови и мочи людей, не получавших вольтарен. Опыты показали,.что из биологических жидкостей не экстрагируются вещества, способные давать цветную реакцию с пероксидом водорода и пероксидазой.

Определение концентрации вольтарена предлагаемым способом в плазме крови больных, получивших вольтарен в процессе лечения ревматоидного артрита, показало близкие величины по отношению к результатам определения вольтарена другими методами. Через 30 мин после пероральноро введения 100 мг вольтар.ена в плазме крови больного было обнаружено 1,85 мгк/мл вольтарена. По известным данным через 30-60 мин после введения вольтарена в дозе 100 мг в плазме крови

5I

больных выявляется 1,0 - 2,9 мкг/мл вольтарена.

Пример 1. Определение вольтарена в инъекционном препарате.

Реактивы: препарат пероксидазы из хрена производства НПО Биохимре- актив, г, Олайне, СССР с исходной активностью 650 ед/мг растворяли в дистиллированной воде и проверяли его активность по методу Симакова, для работы использовали препарат, содержащий 40 ед, активными (мкмоль обесцвеченного индигокармина/мин) в 1 мл; 9,8 ммоль раствор пероксида водорода (0,02 мл 33%-ного раствора пероксида водорода растворяли в 20 мл воды); 0,1 моль калий-фосфатный буфер, рН 7,4.

Ход определения.

Инъекционный препарат вольтарена фирмы Плива с содержанием вольтарена 75 мг/3 мл разводят в 100 раз дистиллированной водой.

К О., мл разведенного раствора вольтарена прибавляют 2,,7 мп калий- фосфатного буфера (рН 7,4), затем 0,1 мл раствора пероксидазы и 0,1 мл раствора пероксида водорода, пробу перемешивают.

Через 45 мин пробы фотометрируют при 455 им на спектрофотометре проти .контроля, который содержит все реактивы, кроме вольтарена.

Расчет ведут по калибровочной кривой.

Пример 2. Определение вольтарена в плазме крови и моче.

Реактивы: х.пороформ; 2,5 н.раство фосфорной кислоты; раствор пероксида зы, содержащий 40 ед. активности в 1 мл (приготовление аналогично примеру 1); 9,8 ммоль раствор пероксида водорода; 0,1 моль калий-фосфатньш буфер, рН 7,4.

Ход определения.

К 1 об. плазмы крови или мочи прибавляют 4 об. 2,5 н. раствора фосфорной кислоты и 5 об. хлороформа к 1 мл плазмь прибавляют 4 мл 2,5 н.

раствора фосфорной кислоты и 5 мл хлороформа .

Пробы перемешивают путем переворачивания (не допуская вспенивания) в

31 , 6 течение 15 мин. После расслоения фаз хлороформный слой переносят в другую пробирку,

К остатку прибавляют такое же количество хлороформа и повторяют экстракцию, Хлороф:ормные экстракты объединяют и упаривают досуха при 40 во С.

К сухому экстракту прибавляют 2,8 МП 0,1 моль калий-фосфат- ного буфера рН 7,4, затем 0,1 мл раствора пероксидазы и Ор мл -раствора пероксида водорода и пе ремешивают.

Пробы фотометрир уют через 45 мин при 455 нм против контроля, который содер;кэ-г; все реактивы, кроме экстракта вольтарена.

При концентрации вольтарена в плазме крови менее 1 мкг/мл можно использовать микрокюветы, пропорционально уменьшив количества прибавляемых реактивов или увеличить объемы плазмы взятых для экстракции.

Использование предлагаемого способа определения вольтарена, более чувствительного (в 10 раз) по сравнению с известным, позволит определять концентрацию вольтарена в биологических жидкостях не только з случае отравления этим препарато(; но и кон гролиро- вать его уровень Б крови болы-ых в процессе лечения. Это дает возможность при необходимости проводить коррекцию доз вольтарена и тем самым повысить качество лечения.

Формула изобретения

Способ определения диклофенака натрия в биологической жидкости путем экстракции, добавления к экстракту реагентов с последующим фотометриро- ванием раствора окрашенного продукта, отличающийся тем, чтО; с целью повьшения чувствительности способа, в качестве реагентов используют раствор пероксидазы в концентрации 1,3-3,3 ед./мл, раствор перекиси водорода 0,49-1,96 мкмоль, буферный раствор с рН 7,2-7,7, а фотометрирова- ние проводят через 30-60 мин после смешивания реагентов при 450-460 нм.

...

Величина оптической плотности за: время после прибавления реактивов, мин

Изобретение относится к методам определения вольтарена в биологических жидкостях. Цель изобретения - повышение чувствительности способа - достигается тем, что определение ведут по цветной реакции вольтарена с пероксидом водорода и пероксидазой, а окрашенный продукт реакции измеряют при 450-460 нм. Способ позволяет определить 0,5 мкг диклофенака натрия в 3 мл пробы. 8 табл., 1 ил.

П р и м е ч а н и 6. В каждой пробе объемом 3 мл содержалось 20 мкг вольтарена, 4 ед. активности пе- роксидазы и 0,98 мкмоль пероксида водорода,

.

Примечание. В каждой пробе объемом 3 мл содержалось 20 мкг вольтарена, 0,98 мкмоль пероксида водорода, рН инкубационной среды 7,4.

Примечание. В каждой пробе объемом 3 мл содержалось 20 мкг вольтарена, 4 ед, активности перок- сидазы, рН среды .

ij а

Примечание. В пробе объемом 3 мл содержалось 20. мкг вольтаре- на, 4 ед. активности пероксидазы, 0,98 мкмоль пероксида водорода, рН 7,4.

«,

5

Примечание. Определение вольтарена вели следзтощим образом: к пробе вольтарена прибавляли 3 мл 5%-ного раствора перйодата натрия в 75%-ной серной кислоте. Окрашенный продукт фотометрировали через 15 мин при 550 нм на спектрофотометре (ко личество раствора перйодата натрия против такового в известном способе было уменьшено с 4 мл до 3 мл для уравнивания фотометрируемых объемов в известном и предлагаемом способах)

I47113I

10

Таблица 6

Примечание. ВоЛьтарен прибавляли к пробам плазмы крови и мочи объемом 0,2 мл.

при 50 нл

т т

100 080

060

W

0.20

-+-1-I-I-I-

2 в 8 10

Составитель В.Митюшин Редактор Е.Папп Техред А.КравчукКорректор М.Пожо

Заказ 1603/47

Тираж 788

ВНИЮШ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР 113035, Москва, Ж-:35, Раушская наб., д. 4/5

Производственно-издательский комбинат Патент, г, Ужгород, ул. Гагарина,101

го

Вольтарен мкг

Подписное