И. В. КУРЧАТОВА и Институт элементоорганических соединений АН СССР Советский патент 1965 года по МПК C12P13/08 

Предлагаемый способ обеспечивает получение /-лизина в больших количествах для широкого применения его в различных от1раслях народного хозяйства.

В сельском хозяйстве ош,ущается недостаток /-лизина, являющегося незаменимой аминокислотой. Добавление его в корм значительно увеличивает суточные привесы, уменьшает расход кормов. Лизин применяют и в пищевой промышленности, а также в медицине.

Известны способы производства /-лизина путем глубинного выращивания его продуцентов на питательной среде, содержащей сахар, азотные, фосфорные соли, кукурузный экстракт, последующего отделения клеток от культуральной жидкости одним из известных приемов, например центрифугированием, очистки фильтрата ионообменными солями, элюции лизина аммиаком с упариванием элюата для удаления последнего, подкисления элюата для перевода лизина в монохлоргидрат, к ристаллизации монохло;ргидрата из раствора при добавлении спирта с последующей сушкой монохлоргидрата.

Предлагаемый способ обеспечивает более качественную очистку /-лизина. Для чего выделяют /-лизин на катионообменной смоле R два этапа: первоначально на смоле в Na форме, а затем в Н+ форме.

Для увеличения выхода /-лизина маточный раствор, получаемый после отделения монохлоргидрата, следует добавлять к исходной культуральной жидкости, подлежащей очистке.

В качестве продуцентов /-лизина целесообразно использовать двойной биохимический мутант M-glntamicus, полученный из исходного штамма одним яз известных приемов, например ультрафиолетовым или рентгеновским облученем, с последующм отбором.

Предлагаемый способ заключается в следующем.

В качестве продуцента /-лизина используют

двойной биохимический мутант M-glutamicus с нарушенным биосинтезом некоторых аминокислот, для чего суспензию клеток M-glutamicus АТСС 13032, образующую лишь следы /-лизина, обрабатывают либо быстрыми нейтронами, либо рентгеновскими лучами, либо ультрафиолетовыми лучами, после чего с помощью селективной методики из IQs-IQe выживших клеток отбирают единичные клетки первичного биохимического мутанта, нуждающегося в гомосерине или метионине с треонином. Затем клетки этого биохимического мутанта вновь обрабатывают быстрыми нейтронами или рентгеновыми лучами и на селективных средах проводят отбор двойных биохимисерина в одной из нижеследующих аминокислот; лейцине, изолейцине, цистеине, дистине, треонине. Хранят полученные штаммы в виде лиофильно высушенных культур в стеклянных ампулах.

Размножают культуру в несколько этапов. Для этого лиофильный материал из ампул высевают на косой агар Хоттингера и инкубируют при температуре 30-33°С в течение 24 час. Культуру с косяка переносят либо иа жидкую посевную среду, содержащую 2% кукурузного экстракта, 2% мелассы и 0,4% NaCl, либо на мясо-пептониый бульон с 2% глюкозы и инкубируют в колбах, на качалке при температуре 2 8-30°С в течение 16-24 час. Выросший посевной материал размножается в инокуляторах иа питательной среде с 2% кукурузного экстракта, 2% мелассы и 0,4% NaCl в течение 18-24 час при температуре 28- 30°С. Инокулят должен содержать не менее 2-5X10 клеток в 1 мл. Посевной материал из инокзлятора передают в ферментер в количестве 0,5-5% (по объему).

При этом для процесса биосинтеза используют любую из четырех следующих сред:

среду № 1 с 15% мелассы, 2% кукурузного экстракта, 2% NHiNOs, 2% технического мела;

среду № 2 с 15% мелассы, 3% рыбного экстракта, 2% NHiCl, 1% технического мела;

среду № 3 с 15% мелассы, 2% , 20% гидролизата арахисового шрота (2% арахиса) и 1% технического- сла;

среду 4 с 6% кукурузного экстракта, 2% NH4NO3 и 3% СаСОз, приготовленную на гидролизате кукурузной кочерыжки с 10% редуцирующих венхестБ, который предварительно нейтрализуют и освобождают от сульфатов.

Первые три среды приготовляют на водопроводной воде.

Перед началом ферментации значение рН должно быть близким к нейтральному (перед стерилизацией рН среды доводят раствором NaOn до 7,1-7,3). Оптимальная аэрация для указанных сред составляет 6-10 мг Оо/л в мин. Оптимальная температура процесса биосинтеза 28--31°С.

При соблюдении оптимальных условий ферментации максимальное накопление /-лизина наблюдается к 60-64 час. В течение последующих 24 час содержание /-лизина остается на том же уровне, после чего содержание его падает.

Спустя 48 н 60 час с начала ферментации из аппаратов отбирают пробы для количественного онределения /-лизина в культуралыюй жидкости, которое проводят методом бумажной количественной хроматографии или микробиологическим методом.

Полученную культуральную жидкость предварительно освобождают от бактериальных клеток и мела, в результате чего получают прозрачную жидкость, свободную от взвещенных частиц. Если в культуральной жидкости отсутствуют нерастворимые неорганические

соли, то очистку не производят. В этом случае культзфальную жидкость подвергают дальнейшей обработке вместе с бактериальными клетками.

Затем культуральиую жидкость, свободную от бактериальных клеток или с ними, пропускают через слой слюлы КУ-2Х8, предварительно переведенной в Na+ форму, соблюдая при этом объемное соотнощение пропушенной

культуральной жидкости к объему смолы, равное 1 : 2 и молярное соотношение неорганических катионов к /-лизину в культуральной жидкости, равное 5:/1-7:1. В случае, если последнее соотнощеиие меньще 2, то на один

объем смолы можно давать 4 объема культуральиой жидкости. При этом смолой удерживается лизин и часть катионов (неоргаиических), отличных от Na+. Сопутствзющие нейтральные и кислые аминокислоты, а также

остатки мелассы и пигментные примеси проходят сквозь смолу, не задерживаясь, и их окончательио удаляют последующей промывкой смолы деиоиизированной водой (3-4 объема деионизированной воды на 1 объем культуральной жидкости).

После промывки водой лизин выделяют из смолы при промывке последней 10-15% водным раствором аммиака, причем собирают ту фракцию, которая показывает величину удельного вращения плоскости поляризованного света, отличную от 0. Контролирзаот процесс иа проточном поляриметре. По окончании сбора нужной фракции промывку смолы аммиаком прекращают и начинают промывать смолу

10-15%-ным раствором NaCl для регенерации Na+ формы. Смолу промывают деионизированной водой до отрицателыюй реакции на С1, после чего смола готова для повторного применения.

Фракцию лизина, содержащ)ю аммиак, обрабатывают для удаления его, например прогревают, после чего водный раствор лизина, содержащий до 8,0% лизина и некоторое количество неорганических солей Na+, пропускают через смолу КУ-2 с любой степенью поперечной сшивки в пределах от 8 до 20 (лучше 20) в форме. Количество смолы, требуемое для этой операции, составляет 0,2- 0,5% количества смолы в Na+ форме. При

происходит удерл ание смолой лизина и

катионов Na. При последующей промывке

деионизированиой В0х4.ой, а затем 10-15%-пым

водным раствором аммиака происходит элюцня лизина с поверхности смолы в чистом виде, практически без катионов Na+. При этом концентрация лизина в собираемой фракции составляет 20,0-40,0%. Аммиак из фракции Здаляют любым способом, например прогревом.

После этого лизин переводят в монохлоргндрат путем добавления расчетных количеств хлористого аммония при нагревании (для удалеиия выделяющегося аммиака) или определенных количеств концентрированной НС1 до

Монохлоргидрат лизина выделяют из полученного раствора после добавления в раствор этилового спирта или после упаривания раствора любым методом до концентрации 60- 80% монохлоргидрата лизина и последующего охлаждения до 5-20°С.

В Последнем случае после отделения осадка, представляющего собой монохлоргидрат /-лизина, маточный раствор добавляют к исходной культуральной жидкости, подлежащей очистке на смоле. Полученный монохлоргидрат /-лизнна после сушки при 80-120°С представляет собой порошок с содержанием 92- 94% монохлоргидрата /-лизина при максимальном содержании золы, равном. 1%. Выход /-лизина, выделенного этим методом, составляет 85%.

Предмет изобретения

1. Способ производства /-лизина путем глубинного выращивания его -продуцентов на питательной среде, содержащей сахар, азотные соли н стимуляторы роста, выделения лизина

из культуральной жидкости на катионообменной смоле, элюции лизина из катионита аммиаком, упаривания элюата для удаления аммиака, подкисления элюата для перевода

лизина в монохлоргидрат и кристаллизации монохлоргидрата из раствора при добавленИ спирта с последующей сушкой монохлоргидрата, отличающийся тем, что, с целью более качественной очистки /-лизина, его выделяю г

на катионообменной смоле в два этапа: первоначально на смоле в Na+ форме, а затем в Н+ форме.

2.Способ по п. 1, отличающийся тем, что, с целью увеличения выхода /-лизина, маточный

раствор после отделения осадка (монохлоргидрата) /-лизина добавляют к исходной культуральной жидкости, подлежащей очистке.

3.Способ по п. 1, отличающийся тем, что в качестве продуцентов /-лизина используют

двойной биохимический мутант M-glutamicus, полученный из исходного штамма одним из известных Приемов, например ультрафиолетовым или рентгеновским облучением, с последующим отбором.