Способ обнаружения эндотоксинов грамотрицательных бактерий Советский патент 1992 года по МПК G01N1/28 

Изобретение относится к медицине и ветеринарии, в частности к лабораторным методам выявления эндотоксинов грамот- рицательных бактерий.

Целью изобретения является повышение чувствительности и упрощение способа.

Указанная цель достигается тем, что согласно способу обнаружения эндотоксинов путем применения флюоресцирующих антител к Re-гликолипиду. исследуемую пробу смешивают с кровью, из крови готовят мазок, который обрабатывают вначале плазмой или сывороткой крови неиммунизированных животных, а затем флюоресцирующими антителами к Re-гликолипиду. О присутствии эндотоксина в исследуемой пробе крови судят по наличию ярко светящихся участков на поверхности нейтрофи- лов при микроскопировании в УФ-свете.

П р и м е р. В качестве исследуемой пробы используют раствор, содержащий липополисахарид К. coll CIII в концентрации 5 10 мкг/мл. 1 мл раствора смешивают с 4 мл крови кролика, выдерживают 30 мин при 37°С, готовят тонкий мазок, фиксируют метанолом в течение 5 мин и отмывают в течение 10 мин фосфатно-солевым буфером (рН 7,2). На мазок наносят сыворотку или плазму крови неиммунизированных животных, выдерживают в течение 30 мин, отмывают тем же фосфатно-солевым буфером в течение 10 мин и наносят флюоресцирующие антитела к Re-гликолипиду Через 30 мин мазок отмывает фосфатно-солевым буфером в течение 10 мин и сразу же подвергают микроскопированию в микроскопе Люмам И1 при увеличении х 350 с иммерсией, На мазке были видны ярко светящиеся участки (1-3 в поле зрения) В отдельных

vi

4 О

VI

СП 00

полях зрений ярко светящиеся участки могут отсутствовать. Заключение о наличии эндотоксина в исследуемой пробе крови делают в том случае, если ярко светящиеся участки обнаружены при просмотре пяти полей зрения.

В контрольном опыте мазки предварительно не обрабатывают нормальной сывороткой кролика. Это приводит к формированию при микроскопировании фоне неспецифического свечения вследствие неспецифического связывания флюоресцирующих антител с клетками крови, что затрудняет выявление ярко светящихся участков специфического связывания и снижает чувствительность способа. Следовательно, обработка мазков нормальной сывороткой подавляет неспецифическую флюоресценцию. Такое же действие оказывает нормальная плазма крови.

Во втором контрольном опыте предварительно обрабатывают намеченными антителами к Re-гликолипиду, а затем - флюоресцирующими антителами к Re-гли0

5

0

5

колипиду. В этом случае светящиеся участки отсутствуют, так как участки специфического и неспецифического связывания флюоресцирующих антител заблокированы намеченными антителами к Re-гликолипиду. Эти данные свидетельствуют о специфичности связывания флюоресцирующих антител к Re-гликолипиду.

Формула изобретения Способ обнаружения эндотоксинов грамотрицательных бактерий путем применения флюоресценции антител к Re-гликолипиду, отличающийся тем, что, с целью повышения чувствительности и упрощения способа, исследуемую пробу смешивают с кровью, из смеси готовят мазок, который вначале обрабатывают плазмой или сывороткой крови неиммунолизированных животных, а затем флюоресцирующими антителами к Re-гликолипиду и по наличию ярко светящихся полиморфно-ядерных лейкоцитов судят о присутствии эндотоксина в исследуемой пробе.

Изобретение относится к медицине и ветеринарии, а именно к лабораторным методам выявления эндотоксинов грамотри- цательных бактерий. Целью изобретения является повышение чувствительности и упрощение способа. Исследуемую пробу смешивают с кровью, инкубируют 30 мин при 37°С и готовят мазок, который фиксируют метанолом, обрабатывают неиммунной сывороткой или плазмой крови, инкубируют 30 мин и отмывают фосфатно-солевым раствором. Затем на мазок наносят флюоресцирующие антитела к Re-гликолипиду, снова инкубируют 30 мин, отмывают и мик- роскопируют в УФ-свете. При наличии в исследуемой пробе эндотоксина на мазке видны ярко светящиеся участки (эндотоксин, фиксированный на полиморфно-ядерных лейкоцитах).