Способ получения ремантадинзависимого варианта вируса гриппа Советский патент 1992 года по МПК C12N7/00 C12Q1/70 

Изобретение относится к вирусологии и может быть использовано, например, в изучении процессов изменчивости вирусов под влиянием химиопрепаратов.

Возможность возникновения химиоп- репаратзависимых вариантов вирусов хорошо известна из истории химиотерапии вирусных инфекций о связи с такими высокоэффективными препаратами как производные бксибензилбензимидэзЪлэ, гуанидина, изатин-Ь-тиосемикЗрбазона. Зависимые варианты вирусов в присутствии этих веществ могут быть легко получены в количествах, достаточных для большинства биохимических и биофизических исследований. Это связано с относительно высокой стабильностью в ходе пассирования, что приводит о итоге к практически полной гибели варианта вируса в отсутствии химиоп- репсрата. Следовательно, возможна четкая

дифференциация этих вариантов от родительских вирусов.

В то, же время ремантадмнзависимый вариант вируса гриппа малостабилен, легко ревертирует при пассировании на клеточной культуре в отсутствии ремантадина, его дифференциация от родительского вируса затруднена, особенно при высокой множественности инфицирования. Это в свою очередь не позволяет получать большие количества ремантадиензависимого вируса.

Известен способ получения ремантэди- ензависимого (измененного) варианта виру- da, заключающийся в том, что монослойную тканевую культуру фибробластов эмбрионов кур (ФЭК) инфицируют 0,00002 БОЕ/клетка вируса гриппа A/FPV/Roctock. покрывают питательной средой на основе концентрата среды 199 с добавлением 1% бактагара и 0,005% нейтрального красного,

VJ

СП

тА

Ю

о

Ј

станавливают в лунку, вырезанную в покрытии после затвердевания, отрезок стекянной трубки и заполняют ее просвет 0,05 мл раствора ремантадина (5 мг/мл), инкубируют в 5% СО атмосфере при 37°С в течение 48 ч. Препарат ремантадиензависимого варианта вируса получают путем выкалывания бляшек, образовавшихся ча чашке в непосредственной близости покруг зоны токсичности и отделенных от бляшек родительского вируса зоной подавления образования бляшек.

Недостатком способа является малое количество вируса в препарате, Попытка повысить множественность инфицирования для увеличения выхода приводит к образованию сливных бляшек и невозможности их четкой дифференциации вследствие исчезновения зоны подавления образования бляшек. Способ имеет скорее демонстрационное, чем препаративное значение. Нак-ап- ливание с его помощью количества вируссодержащего материала, необходимых, например, для электронной микроскопии, электрофоретического исследования компонентов вибрионов практически невозможно,

Наиболее близким к изобретению является способ получения ремантадин- зависимого варианта вируса путем инфици- рования монослойиой культуры ФЭК 0,0001-0.001 ТЦД50/клетка вируса гриппа A/FPV/Rostock, нанесения поддерживающей среды (среда 199) с растворенным в ней 6-25 мкг/мл ремантадина, инкубации в течение 48 ч при 37°С и сбора культуральной жидкости как материала, содержащего необходимый вариант вируса. Способ позволяет получить более значительные количества ремантадинзависимого варианта вируса, который может быть подвергнут дальнейшей обработке с помощью обычных приемов очистки и концентрирования вируссодержащего материала.

Недостатком способа является малый выход ремантадинзависимого варианта вируса. Это связано с плохой дифференциацией этого варианта от родительского (инфицирующего) вируса, основанной только на вирусингибирующих свойствах использованных и более низких концентраций ремантадина в отношении, инфицирующего вируса. Если же создаются условия для получения материала в больших количествах (задается высокая множественность инфекции), становится невозможным разделение. поскольку размножаются оба - реманта- динзависимый вариант и родительский вирус. Ингибиругащее действие ремантадина недостаточно в этих условиях как разделяющим (подавляющий размножение родительского вируся) фактор В связи с этим возможна только низкая множественность инфицирования что недостаточно для не- которых видов исследования, например авторадиографического изучения инфицированных клеток в течение первого цикла репродукции вируса. Кроме того, невозможно накапливание ремантадинзависимого 0 варианта при инфицировании вирусом, устойчивым к действию ремантадина, так как вирусингибирующио свойства в отношении родительского вируса и, следовательно, дифференциация материала от исходных 5 частиц ослаблены.

Целью изобретения является увеличение выхода и повышение однородности получаемых препаратов ремантадинзависимого варианта вируса гриппа. , 0 Поставленная цель достигается добавлением в поддерживающую сроду ремантадина в концентрации 6-25 мкг/мл и рибавирина в концентрации 3-25 мкг/мл.

Новизна изобретения заключается в 5 сочетанном использовании ремантадина и рибавирина для получения ремантадинзависимого варианта вируса. Было известно, что ремантадин и рибавирин при совместном использовании проявляют синергид- 0 ный ингибирующий эффект на размножение вирусов гриппа. Не было известно и явилось неожиданным отсутствие ингибирующего эффекта рибавирина в отношении ремантадинзависимого варианта вируса при его 5 получении в условиях одновременного присутствия ремантадина и рибавирина в среде поддержки. Нельзя было предполагать возможность образования ремантадинзависимого варианта вируса в присутствии 0 ремантадина и рибавирина. Напротив, имеющиеся данные свидетельствуют о затрудненном образовании даже устойчивости вируса гриппа к комбинации ремантадин + рибавирин вследствие разноплановости 5 способа антивирусного действия обоих ингибиторов.

Положительный эффект изобретения заключается в повышении надежности дифференциации материала ремантздинзави- 0 симого варианта вируса от родительского вируса, что позволяет значительно увеличить множественность инфицирования и получить таким образом высокий урожай при инфицировании тканевой культуры да- 5 же вируссом, устойчивым к действию ремантадина.

Пример 1. Монослрймые тканевые

культуры ФЭК инфицируют 0,01 БОЕ/клетка вируса гриппа A/FPV/Rostock и его оарианта. устойчивого к действию ремантадина.

После 1 ч контакта с клетками вируссодбр- жащую жидкость удаляют и наносят свежую среду поддержки (среда 199) с растворенными в ней ремантадином и рибавирином в концентрации 25 мкг/мл. После 48 ч инкубации при 37°С учитывают цитопатический эффект (ЦПЭ) вирусов под малым увеличением (х80) микроскопа. Полученные результаты сводят в таблицу.

Как видно из представленных результатов, при инфицировании тканевой культуры вирусом A/FPV/Rostock зарегистрирована 100%-ная выраженность ЦПЭ (строка 6, колонка 9 в таблице). Такая же выраженность ЦПЭ отмечена в присутствии 6-25 мкг/мл ремантадина при инфицировании этим же вирусом (строки 1-3, колонка 9). Частичное подавление развития ЦПЭ отмечено в присутствии 0,7 и 0,1 мкг/мл ремантадина (строки 4 и 5, колонка 9).

Таким образом, концентрации ремантадина 6-25 мкг/мл соответствуют диапазону образования ремантадинзависимого варианта вируса, а более низкие его концентрации - диапазону подавления размножения исходного вируса. Вследствие относительно высокой множественности инфицирования полное подавление размножения исходного вируса в концентрациях 0,7 и 0,1 мкг/мл ремантадина не наблюдается. В связи с этим не исключается возможность появления в присутствии более высоких концентраций (6-25 мкг/мл) смешанной популяции вирусного потомства, в которой наряду с частицами ремантадинзависимого варианта вируса присутствуют частицы, структурно и функционально соответствующие частицам исходного (инфицирующего) вируса.

Если инфицирование тканевой культуры выполняют вирусом A/FPV/Rostock, устойчивым к действию ремантадина, выраженность ЦПЭ в присутствии всех концентраций ремантадина достигает контрольной, 100% (колонка 10 в таблице). Следовательно, в этом случае какая-либо гарантия соответствия концентраций ремантадина 6-25 мкг/мл диапазону образования ремантадинзависимого варианта вируса отсутствует.

В то же время, при инфицировании тканевой культуры как вирусом A/FPV/Rostock, так и его вариантом, устойчивым к действию ремантадина, одновременное присутствие ремантадина и рибавирина (25 мкг/мл) приводит к проявлению ЦПЭ только в диапазоне концентраций ремантадина 6-25 мкг/мл (строки 1-3, колонки 3-4). В присутствии ремантадина в более низких концентрациях в комбинации

с рибавирином ЦПЭ отсутствует так же, как и в присутствии только одного рибавмрина (строки 4-6, колонки 3-4). Это свидетельствует о том, что в условиях присутствия в 5 поддерживающей среде ремантадина и рибавирина одновременно происходит полное подавление размножения исходного (инфицирующего) вируса при свободном размножении ремантадинзависимого вари10 анта вируса в том же диапазоне концентраций ремантадина, который отмечен как диапазон образования ремантадинзависимого варианта вируса при использовании только одного ремантадина.

15 При совместном использовании ремантадина и рибавирина в диапазоне концентраций ремантадина 6-25 мкг/мл имеет место менее высокая выраженность ЦПЭ в сравнении с группами, в которых присутст0 вовал только один ремантадин в этих же. концентрациях (строки 1-3, сравнивают колонки 3, 4 и 9, 10). Эти данные отражают подавление размножения части популяции вирусного потомства. соответствующей ис5 ходному (инфицирующему) вирусу в условиях сочетанного использования ремантадина и рибавирина.

Пример иллюстрирует возможность четкой дифференциации ремантадинзави0 симого варианта вируса гриппа от исходного (инфицирующего) вируса в условиях как повышенной множественности инфицирования, так и при использовании ремантади- нустойчивого варианта вируса в качестве

5 инфицирующего путем комбинации 6- 25 мкг/мл ремантадина с 25 мкг/мл рибавирина.

Пример 2. Операции по способу, изложенному в примере 1, выполняют с

0 12 мкг/мл рибавирина. Отмечают полное подавление размножения исходного вируса в присутствии 0,7 и 0,1 мкг/мл ремантадина (строки 4 и 5, колонка 5 в таблице) и частичное без ремантадина (сравнивают колонки

5 5 и 9 в строке 6). В результате более четко проявляется диапазон образования ремантадинзависимого варианта вируса (25- 6 мкг/мл, строки 1-3, колонка 7) Если инфицирование проводят вирусом гриппа,

0 устойчивым к действию ремантадина, подавление размножения вируса отмечают только в пределах диапазона образования ремантадинзависимого варианта вируса, но не в более низких концентрациях (сравнива5 ют колонки 8 и 10). Сам по себе рибавирин в заданной концентрации не обеспечивает антивирусного действия в отношении ре- мантадинустойчиоого вируса

Пример иллюстрирует возможность

дифференциации ремантадин-зависимого

варианта вируса от исходного (инфицирующего) вируса, чувствительного к действию ремантадина, путем комбинации 6- 25 мкг/мл ремантадина с 12 мкг/мл рибави- рина, и недостаточность такой комбинации для дифференциации при использовании в качестве исходного вируса, устойчивого к действию ремантадина.

Пример 3. Операции по способу, изложенному в примере 1, выполняют с 3 мкг/мл рибавирина. Отмечают полное подавление размножения исходного вируса в присутствии 0,7 и 0,1 мкг/мл ремантадина (строки 4 и 5, колонка 7 в таблице). Подавление размножения вируса без ремантадина отсутствует (сравнивают колонки 7 и 9 в строке 6). В результате более четко проявляется диапазон образования ремантадинза- висимого варианта вируса (25-6 мкг/мл, строки 1-3, колонка 7). Если инфицирование проводят вирусом гриппа, устойчивым к действию ремантадина, подавление размножения вируса отмечают только в л ре делах диапазона образования реманта- динзависимого варианта вируса, но не в бо- лее низких концентрациях (сравнивают колонки 8 и 10). Сам по себе рибавйрйн в заданной концентрации не обеспечивает антивирусного действия в отношении ре- мантадинустойчивого вируса (сравнивают колонки 8 и 10 в строке 6).

Пример иллюстрирует возможность дифференциации ремантадинзависимого варианта вируса от исходного (инфицирующего) вируса, чувствительного к действию ремантадина, путем комбинации 6- 25 мкг/мл ремантадина с 3 мкг/мл рибавирина, и недостаточность такой комбинации для дифференциации при использовании в качестве исходного вируса, устойчивого к действию ремантадина.

Пример 4. Монослойные тканевые культуры ФЭК инфицируют2-2,5 БОЕ/клет- ка вируса гриппа A/FPV/Rostock путем контакта вируссодержащей жидкости с клетками в течение 1 ч. Неадсорбированный на поверхности клеток вирус удаляют, клетки покрывают свежей средой 199 с растворенными в ней ремантадином, риба- вирином или обоими химиопрепаратами вместе. Через 1 ч инкубации при 37°С в среду поддержки вводят 25 мКи/мл 140-гид- ролиэата хлореллы. Спустя еще 5 ч инкубации при 37°С монослой лизируют в буфере образца (2% додецилсульфата натрия, 5% 2-меркаптозтанола, 0,05 М трис-HCI рН 6,8, 5% глицерина, 5 мг/мл бромфенрлового синего), прогревая при 100°С в объеме 150- 200 мкл. Электрофорез белков проводят в 12%-ном полиакриламидком геле на 0,275

М трис-HCI рН 8,8 (разделяющий гель). В качестве фокусирующего геля используют 5% акриламид в 0,125 М трис-HCI рН 6,8. После разделения белков гель высушивают и получают автографы на рентгеновской пленке обычным путем.

Для определения принадлежности к ре- мантадинзависимому варианту вируса используют один из характерных признаков, отличающих этот вариант от исходного (инфицирующего) вируса: сниженное количество М-белка и гемагглютинина и недостаточное расщепление последнего.

Добавление ремантадина в концентрации 20 мкг/мл не приводит к проявлению характерного признака ремантадинэависи- мого варианта вируса в сравнении с вирусом, размножавшимся в отсутствии химиопрепаратов. В то же время в присутствии ремантадина в концентрации 20 мкг/мл и рибавирина в концентрации 25 мкг/мл одновременно снижается плотность негатива в области разделения полипептидов с относительно низкой молекулярной массой, М и НА2, за счет уменьшения количества и неполного расщепления гемагглютинина.

Пример демонстрирует возможность использования комбинации ремантадина и рибавирина для дифференциации ремантадинзависимого варианта вируса от исходного при исследовании полипептидного состава в условиях высокой множественности инфицирования.

Таким образом данное решение позволяет достигнуть поставленную цель. При использовании комбинации 6-25 мкг/мл ремантадина и 25 мкг/мл рибавирина удается получить увеличение выхода ремантадинзависимого варианта вируса гриппа при высокой множественности инфицирования, а также в случае использования в качестве исходного (инфицирующего) ремантадину- стойчивого вируса. В том Случае, если в качестве исходного использован вирус, чувствительный к действию ремантадина, дифференциацию ремантадинзависимого варианта удается получить и при использовании комбинации 6-25 мкг/мл ремантадина и 3-12 мкг/мл рибавирина. Для дифференциации ремантадинзависимого вируса при использовании в качестве инфицирующего ремантадинустойчивого вируса такая комбинация недостаточна.

Следовательно, при оптимальном сочетании концентраций двух химиопрепаратов становится возможным накапливание ремантадинзависимого варианта вируса и использование для его изучения методов, требующих высокой множественности инфицировамия Кроме того, о любом случае достигается более высокая однородность получаемых препаратов ремантадинзависи- мого варианта вируса, что способствует получению более адекватных результатов.

Изобретение может быть использовано в исследовательской лабораторной практике для увеличения выхода (урожая) реманта- динзависимого варианта вируса гриппа.

Учитывая имеющиеся сведения о распространенности явления образования хи- миопрепаратзависимых вариантов вируса на целый ряд алициклических производных, обладающих противовирусными свойствами, следует ожидать столь же позитивного

эффекта от применения комбинаций и этих веществ с рибэвирином.

Формула изобретения Сп.особ получения ремз-нтадинзэвисимого варианта вируса гриппа путем инфицирования клеточной культуры, последующего введения ремантадина в состав поддерживающей среды в концентрации 6-25 мкг/мл и сбора материала после завершенич инку бации, отличающийся тем, что, с целью увеличения выхода и повышения однород ности получаемых препаратов ремантадин- зависимого оарианта вируса, в состав поддерживающей среды дополнительно

вводят рибавирин в концентрации 3- 25 мкг/мл.

Использование: вирусология, изучение процессов изменчивости вирусов под влил- нием химиопрепаратов. Сущность изобр е- тения: в поддерживающую среду добавляют ремантадин в концентрации 6-25 мкг/мл и рибавирин в концентрации 3-25 мкг/мл. 1 табл. СЛ

Влияние комбинации ремантадина + рибавирин на развитие цитопатического эффекта вирусов гриппа о тканевой культуре.

Примечания: ЦПЭ оырах ен в процентах; FPV вирус A/FPV/Rostock; FPVR - вирус A/FPV/Rostock, устойчивый к действию ремантадина.