Способ получения культуральной жидкости SеRRатIа маRсеSсеNS, обладающей хитиназной активностью Советский патент 1993 года по МПК C12N9/42 C12N9/42 C12R1/43 

Изобретение относится к биотехнологии и касается получения ферментов хити- наз, в частности хитиназы Serratia marcescens (К.Ф.3.2.1.4), которая может быть использована для биоконверсии хи- тинсодержащих отходов в белок одноклеточных дрожжей, борьбы с насекомыми, патогенными грибами и нематодами, вредителями сельскохозяйственных растений, в качестве биохимического реактива при количественном и качественном определении хитина в составе клеточной стенки грибов и других биологических объектов, для разрушения клеточной стенки грибов.

Целью изобретения является повышение активности и упрощение способа.

Поставленная цель достигается тем, что мутантный штамм S. marcescens 28-13 (коллекционный номер ВКПМ В-4870) выращивается на водной питательной среде, содержащей в качестве источника углерода - глицерин, источник азота - цитрат аммония. источника фосфора - калий фосфорнокислый двузамещенный, источника витаминов - кукурузный экстракт, а также натрий хлористый, магний сернокислый и железо сернокислое. Культивирование проводили на качалке в течение 24 ч при 30°С.

Пример 1. При постановке опытов используют среду следующего состава, г/л: глицерин 5,0; цитрат аммония 5.0; К2НР04 10,0; MgS04 7H20 0,5; NaCI 0.5: FeS04 0,025;

кукурузный экстракт 15 (по сухой массе). рН среды 7,6.

Подготовка посевного материала. Культуру S. marcescens 28-13 выращивают в течение суток в пробирках со скошенным мясопептонным агаром при 30°С. Выросшие клетки смывают 0,5% физиологическим раствором. Полученный таким образом посевной материал засевают в колбы с питательной средой из расчета 0,05 оптических единиц (Дбзо) на мл среды.

Постановка опыта. Посевной материал засевают в конические колбы с 200 мл питательной среды. Отношение объема питательной среды к объему колбы 1:5. Посевы выращивают на качалке (200 об/мин) при 30 С в течение 72 ч. Пробы отбирают через каждые 24 ч. Бактериальные клетки отделяют центрифугированием при 16000 g в течение 10 мин. В надосадочной жидкости определяют хитиназную активность и содержание белка по методу Лоури.

Определение хитиназной активности. Хитиназную активность определяют по количеству образующегося при гидролизе коллоидного хитина Ы-ацетил-О-глюкоза- мина с динитросалициловой кислотой согласно методике (1).

Инкубационная смесь объемом 1 мл содержит 0,5 мл 0,1 М фосфатного буфера, рН 6,75; 0,4 мл 1,25% коллоидного хитина, 0,1 мл культуральной жидкости. Реакционную смесь инкубируют при 50°С в течение 30 мин. Затем пробы разбавляют в 2 раза дистиллированной водой, негидролизованный хитин отделяют центрифугированием при 7000 об/мин в течение 10 мин, а в надосадочной жидкости определяют количество N- ацетил-О-глюкозамина. Для этого к пробе 1 мл добавляют равный объем реактива, содержащего динитросалициловую кислоту и нагревают в кипящей водяной бане в течение 15 мин. Пробы охлаждают и измеряют поглощение при 570 нм. Количество М-аце- тил-О-глюкозамина рассчитывают по калибровочной кривой. За единицу принимают количество фермента, которое при гидролизе коллоидного хитина освобождает 1 мкМ М-ацетил-О-глюкозамина за 1 ч инкубации.

Коллоидный хитин получают согласно известной методике. К 1 г тонко размолотого хитина добавляют последовательно 5 мл ацетона и 30 мл концентрированной соляной кислоты при постоянном перемешивании. Полученную однородную смесь фильтруют через стеклоткань так, чтобы фильтрат поступал в колбу, содержащую 1,5 л 30%-ного этанола при постоянном перемешивании. Через 2 ч хлопья коллоидного хитина отделяют центрифугированием при 3000 g 30 мин и отмывают от кислоты дистиллированной водой до нейтрального рН.

Коллоидный хитин дополнительно гомогенизируют, диализуют в течение суток против воды и используют в опытах.

Уровень хитиназной активности через 24 ч выращивания равнялся 117 ед. через 48

ц 122 ед. через 72 ч 123 ед. Таким образом. высокий уровень хитиназной активности в культуральной жидкости достигается на 24 ч культивирования и практически не увеличивается в процессе дальнейшего выращивания бактерий в течение 72 ч.

Уровень хитиназной активности, равный 117-127 ед на мл культуральной жидкости, в 2,2 раза превышает хитиназную активность, полученную ранее (прототип).

Сравнительные данные хитиназной активности S. marcescens, полученные различными авторами при использовании разных способов, суммированы в таблице.

Таким образом, предлагаемый нами

способ получения культуральной жидкости S. marcescens с хитиназной активностью позволяет на более простой среде, не содержащей хитина, за более короткое время ферментации получить вдвое большее количество хитиназы. Штамм 28-13 внедряется в производство как высокопродуктивный продуцент эндонуклеазы. Предлагаемый способ получения культуральной жидкости с хитиназной активностью с использованием штамма 28-13 не требует изменений в технологическом процессе при его внедрении в производство.

Формула изобретения

Способ получения культуральной жидкости Serratia marcescens, обладающей хитиназной активностью, предусматривающий культивирование в условиях аэрации и

перемешивания штамма продуцента на водной питательной среде, содержащей источники углерода, азота, витаминов, фосфора и сернокислый магний, отличающий- с я тем, что, с целью повышения активности

и упрощения способа, в качестве продуцента используют штамм Serratia marcescens ВКПМ В-4870, культивирование ведут в течение 24 ч на среде, дополнительно содержащей хлористый натр ий, сернокислое

железо, в качестве источника углерода - глицерин, источника азота - цитрат аммония, источника фосфора - фосфорнокислый двузамещенный калий и источника витаминов - кукурузный экстракт

Примечание. М-АГА-М-ацетил-О-глюкозамин.

Использование: биотехнология, касается способа получения культуральной жидкости Serratia mercescens с хитиназной активностью. Хитиназа (К.Ф. 3. 2.1.4) может быть использована для биоконверсии хи- тинсодержащих отходов в белок одноклеточных дрожжей, борьбы с насекомыми и патогенными грибами, вредителями сельскохозяйственных растений, как биохимический реагент в лабораторной практике. Сущность изобретения: осуществляют культивирование мутантного штамма Serratia marcescens ВКПМ В-4870 на среде, содержащей, г/л: цитрат аммония 5,0; глицерин 5,0; К2НРО« 10,0; MgS04«7H20 0.5; NaCI 0,5; FeO/jO,025; кукурузный экстракт 2,5; рН среды 7,6 в течение 24 ч при 30°С с аэрацией. 1 табл. fe