Штамм бактерий СоRYNевастеRIUм INSIDIоSUм - продуцент полисахарида, стимулирующего образование фактора некроза опухоли и интерлейкина-1 Советский патент 1992 года по МПК C12N1/20 C12P19/04 

Изобретение относится к микробиологии, а именно к штаммам микроорганизмов, используемых в микробиологической и медицинской промышленности для получения иммуномодуляторов в частности полисахаридов, обладающих способностью стимулировать образование фактора некроза опухоли (ФНО) и интерлейкина-1 (ИЛ-1) в клетках человека и животных.

Известно использование Mycobacterlum tuberculosis, M. bovls, Proplonlbacterlum acnes в качестве продуцентов липоарабино- маннанов, проявляющих иммунотерапев- тическое действие против опухолей. Выращивание указанных продуцентов проводится на средах, содержащих дорогостоящие реактивы. Культивирование продуцентов проводят в течение длительного периода времени (от 4-х суток до 5-ти недель в зависимости от исследуемой культуры). Выделение

липоарабиноманнанов из указанных продуцентов является трудоемким многостадийным процессом, включающим сложную технологию концентрации и очистки препарата на молекулярных ситах и аффинных сорбентах. M. tuberculosis вызывает у человека туберкулез, поэтому является опасным для работы продуцентом.

В качестве продуцента липополисаха- рида, проявляющего способность индуцировать образование ФНО и ИЛ-1, используется Escherlchia coli. Выращивание указанного продуцента проводится на средах, содержащих дорогостоящие реактивы - мясо-пептонный бульон, мясо-пептон- ный агар. Выход липополисэхарида -- 4-5% от сухой массы клеток. Липополисахарид получают экстракцией клеток. Липополиса- харид получают экстакцией клеток горячим водным фенолом. Этот реактив ярляегся

XS

О

СА СЯ

очень токсичным для людей. Наличие липи да А в составе липополисахарида обусловливает его токсические свойства, пирогенность. Максимально переносимая доза липополисахарида в опытах на белых мышах 0,125 - 5,00 мг/мг; ЛД so равняется 2 - 3, 5 мг/кг. Кроме того, получаемые вод- нофенольным методом липополисахармды содержат обычно высокий процент нуклеиновых кислот. Указанные обстоятельства обусловливают невозможность терапевтического применения липополисахаридов для человека и животных..

6 свЯзй с этим перспективным является использование штампов микроорганизмов, выращивание которых проводится на дешевых синтетических средах, получение полисахаридов из которых будет более экономичным, безвредным и менее трудоемким и проявляют высокую активность в стимуляции образования ФИО и ИЛ-1, Предлагаемый биополимер иной химической природы, в нем отсутствует липид А, обусловливающий токсичность липополисахаридов. В связи с тем, что полисахариды нетоксичны, они могут быть использованы в качестве терапевтических препаратов.

Предлагаемый штамм - продуцент полисахарида, являющегося эффективным индуктором образования ряда цитокинов ФИО и ИЛ-1.

Целью изобретения является получение активного штамма, находящегося в отечественной коллекции, - продуцента полисахарида, проявляющего способность стимулировать образование ФИО и ИЛ-1.

Штамм Corynebacterium Insldlosum ИМВ 7246 б, обладающий указанными свойставми, выделен из пораженных стеблей люцерны. Для этой цели часть пораженной ткани на границе с внешне здоровой тканью вырезали скальпелем, промывали в течение 15-20 мин несколькими порциями стерильной воды. Затем растительную ткань растирали в стерильной ступке с небольшим количеством стерильной воды и образующуюся гомогенную кашицу высевали петлей на поверхность агара в чашках Петри. Чашки помещали в термостат (температура (25 ±3}°С. Питательными средами для выделения бактерий обычно служат: картофельный агар, картофельный агар + 1 % глюкозы, картофельный агар +1 % дрожжевого экстракта, мясо-пептонный агар.

Культуру хранят: на косяках с картофельным агаром при комнатной температуре либо в пробирках на косяках с картофельным агаром, поверхность которого заливают минеральным маслом.

Состав среды картофельный агар: на 1 л дистиллированной воды 200 г картофеля, 0.5% хлористого натрия, 1,5-2,0% агара, рН 7,0-7,2. Штамм Corynebacterium

Insidiosum ИМВ 7246 б депонирован в коллекции культур Всесоюзного научно- исследовательского института антибиотиков Минмедмикропрома и имеет регистрационный N 2060.

Штамм С. Insldlosum ИМВ 7246 б имеет следующие морфологические и биохимические признаки.

Морфологические признаки, Клетки - неспороносные палочки (0,4-0,6 0,7-1,1

мкм), прямые, иногда слабо изогнутые. Располагаются одиночно, парами, могут Y-об- разно. Грамположительные.

Культуральные признаки. Хорошо растет на обычных питательных средах. На картофельном агаре - колонии круглые, гладкие, приподнятые, блестящие, слабо слизистые, прозрачные, желтого цвета.

На мясо-пептонном агаре - колонии круглые, гладкие, более прозрачные, чем

при росте на картофельном агаре, слабо слизистые, желтого цвета, со временем маслообразной консистинции.

При росте в мясо-пептонном бульоне - культура растет умерен но, образует нежную

пленку и осадок.

Культура растет а аэробных условиях, оптимальная температура роста 21-24°С, минимальная 1°С, максимальная 28-31°С. Биохимические признаки Культура не

образует кислоту из глюкозы, лактозы, мальтозы, сахарозы, мзннита, рамнозы,салицина Молоко пептонизирует, желатин слабо разжижает, нитраты не редуцирует, не образует индол и сероводород

Используют глюкозу, сахарозу, лактозу, галактозу, глицерин, крахмал.

Факторы роста - биотин, никотиновая кислота, гистадин, пуриновые и пиримиди- нсвые основания.

Безвредность. Штамм С. insidiosum ИМВ 7246 б не вирулентен, не токсичен для теплокровных животных. Введение 24-часовой культуры С. insidiosum ИМВ7246бвнутрибрюшинно, подкожно и перорально в дозах 5 и 10 млрд микробных клеток на 1 мышь, а также фильтратов среды роста (после культивирования бактерий на жидкой синтетической среде) не вызывала у животних патологического процесса, регистрируемого клинически или при макроскопическом изучении внутренних органов животных.

Штамм ИМВ 7246 б С. insidiosum не патогенен для теплокровных животных.

Выращивание бактериальной массы С. insidlosum ИМВ 7246 б и получение полисахарида из него осуществляли следующим образом. Для получения инокулята используют 24-часовую культуру, выращенную на картофельном агаре при (25 ± 3)°С. Выращивание продуцента осуществляют в колбах объемом 500 мл, содержащих 200 мл жидкой синтетической среды следующего состава, г/л: MgSCh 0,2; Na2HPO-i 6,0; КН2Р04 3,0; NHoCI 1,0; глюкоза 5.0. Стоимость 1 л среды дешевле более, чем в 10 раз.

Из выращенной культуры продуцента выделяют целевой продукт мягким щелочным гидролизом клеток.

Пример 1. Культуру С. Insldiosum ИМВ 7246 б, храняющуюся на косяках с картофельным агаром, засевают на косяк с той же средой и выращивают в термостате при (25 ± 3)°С в течение 24 ч. Затем культуру смывают с косяков жидкой питательной средой описанного состава и засевают в колбы емкостью 500 мл, содержащие 200 мл аналогичной питательной среды; выращивают в условиях качалок (240 об/мин) в течение 35 ч. Клатки осаждают центрифугированием при 5 СОО об/мин в течение 20-25 мин. промывают физиологическим раствором и подвергают гидролизу в 5%-ном растворе КОН/100 мл на 10 г влажных клеток в течение 1,5-2,0 ч. Гидролизат диализуют против водопроводной.а затем дистиллированной воды до нейтрального значения рН, центрифугируют для осаждения неразрушенных клеток, а также загрязняющих компонентов клеточной стенки при 5 000 об/мин в течение 20-25 мин. Полисахарид осаждают из надосадочной жидкости добавлением 5-ти объемов спирта. Осадок освобождают от липидов последовательной обработкой ацетоном, эфиром, а затем смесью хлороформа с метанолом (2:1) и подвергают ионообменной хроматографии на ДЭАЭ-ТСК гелях. Полисахарид, целевой продукт, элюируют 0,25 М фосфатным буфером, рН 6,0 (фиг.1). Фракции полисахарида собирают, диализуют против водопроводной, а затем дистиллированной воды, лио- фильно высушивают. В целевом продукте содержится до 80% углеводов.

Моносахаридыый состав целевого продукта изучали методом газожидкостной хроматографии (фиг.2) и 13С-ЯМР-спектро- скопии. Установлено, что полисахарид состоит из тетрасахаридных повторяющихся звеньв, представленных остатками галактозы и рамнозы. В качестве кислого компонента присутствует пировиноградная кислота.

Молекулярная масса полисахарида, установленная гель-фильтрацией на сефарэзе 6В. составляет 70 000.

Выход очищенного полисахарида составляет 10% от сухой массы клеток.

Выделенный полисахарид проверяют на способность стимулировать образование ФИО и ИЛ-1.

Способность полисахарида индуцировать образование ФИО и ИЛ-1 исследовали в культуре стимулированных тиогликолэтом мышиных перитонеальных микрофагов (МФ). Перитонеальные МФ собирали путем промы вачия брюшной полости мышей линии DBA средой RPMI-1640. отмывали центрифугированием и вносили в лунки плат (Linbro) в концентрации 1,0 106 клеток/мл. После 2 ч инкубации при 37°С в атмосфере 5% С02 и 95% влажности монослой МФ в

каждой лунке тщательно отмывали для удаления неприлипших клеток. Затем в лунки вносили свежую среду с 2 мМ L-глутамина и 80 мкг/мл гентамицина, а также исследуемый полисахарид в соответствующей концентрации.

После 20 ч культивирования надосадоч- ные жидкости культур МФ тестировали на наличие в них ФИО и ИЛ-1.

Исследование активности ФИО в супер- натантах макрофагальных культур проводили по методу (Fish et а). В качестве клеток-мишеней используют мышиные фиб- робласты линии L 929, полученные из коллекции клеточных культур Института цитологии АН СССР. Единицы цитотоксиче- ской активности ФНО рассчитывали по уровню 50%-ной цитотоксичности путем использования Logit-log преобразования и

анализа полученных прямых. Стандартная кривая, построена по рекомбинант- ному ФНО.

Содержание ИЛ-1 в исследуемых супер- натантах МФ оценивали по их комитогенно- му эффекту в реакции блаонок трансформации (РБТ) мышиных тимоцитов в присутствии субоптимальной дозы (0.5 мкг/мл КонА). Результаты РБТ оценивали по уровню включения 3Н-тимидина во вновь синтезируемую ДНК лимфоцитов. Интенсивность включения метки в культуры лимфоцитов определяли на / -счетчике.

Способность полисахарида С. insHiosum ИМВ 7246 б в концентрации 10 мкг/мл стимулировать образование ФНО и ИЛ-1 перитонеальными МФ мышей более, чем в два раза превышает способность ли- пополисахарида Escherlchia coll 055:B5,

производимого американской фирмой Sigma (таблица).

Таким образом, предлагаемый штамм ИМА 7246 . Insldiosum является штаммом, продуцирующим полисахарид, являющийся активным индуктором образования фактора некроза опухоли и интерлейкина-1.

Влияние полисахарида на способность макрофагов стимулировать образование ФИО и ИЛ-1

Выращивание культуры продуцента более, чем в 10 раз дешевле выращивания Е. coll.

0

Полисахарид в отличие от липополиса- харидэ Е. coll является не токсичным и не обладает побочными действиями.

Изобретение может быть использовано в микробиологической промышленности и в медицине, при этом не требуется дополнительных ассигнований для осуществления технологических процессов выращивания продуцента и выделения из него полисахарида.

Формула изобретения

Штамм бактерий Corynebacterium Insldiosum ВНИИА 2060 - продуцент полисахарида, стимулирующего образование фактора некроза опухоли и интерлейкина -1.

Использование: биотехнология. Сущность изобретения: штамм Corynebacterium Insldlosum выделен из стеблей люцерны. При росте на жидкой синтетической среде, в которой в качестве источника азота используют хлористый аммоний, а углерода - глюкозу, клетки синтезируют полисахарид, обладающий способностью индуцировать образование фактора некроза опухоли и ин- терлейкина-1 в клетках человека и животных Полисахарид состоит из нейтральных моносахаридов - галактозы и рамнозы, кислая природа обусловлена присутствием пи- ровиноградной кислоты. Полисахарид может быть использаван при лечении опухолевых процессов, а также различных имму- нодефицитных состояний. 2 ил.

«№ 2,0

W 0,01 М 0,25 М NafyPOt NafyPOb

. о

50WOШ

Номера фракций ИМВ 72М б мв МЭАЭ-7СК геле

Фиг.1

0,50 Ш Vaty/ty

Фиг. 2