Штамм бактерий СоRYNевастеRIUм SереDоNIсUм - продуцент полисахарида, обладающего митогенной активностью Советский патент 1989 года по МПК C12P19/04 C12P19/04 C12R1/15 

1

(21)4293386/31-13

(22)03.08.87

(46) 13.07.89. Вюл. № 26

(71)Институт микробиологии и вирусологии им.Д.К.Заболотного

(72)Л.Д.Варбанец.И.Я.Захарова, Р.И.Гвоздик, В.А.Мурас, А.Ф.Фролов, С.Л.Рыбалко, С.Т.Дядюн, И.Л.Маричев и Ю.П.Галагуза

(53)663.18 (988.8)

(56)Патент Великобритании № 1174322, кл. С 12 Р 19/02, 1969.

Федоровская Е.А., Калинина Н.А. и др. Митогенные свойства липополиса- харидов, выделенных из различных сероваров Eseherichia coli. - Микробиологический журнал, 1984, 46, № 4, с.26-29.

(54)ШТАММ BAKTEPrai CORYNEBACTERIUM SEPEDONICUM - ПРОДУЦЕНТ ПОЛИСАХАРИДА, ОБЛАДАЮЩЕГО МИТОГЕННОЙ АКТИВНОСТЬЮ

(57)Изобретение относится к микробиологии и касается нового штамма

бактерий Corynebacterium sepedonicum ВНИИА № 1834 - продуцента полисахарида, обладающего митогенной активностью. Цель - повышение безвредности митогенного препарата и экономичности, а также снижение трудоемкости его получения. Штамм выделен из больных клубней картофеля, хранится на косяках картофельного агара. Полисахарид получают выращиванием культуры на жидкой среде, содержащей глюкозу и хлорид аммония в качестве источников углерода и азота соответственно, при 23+3 С, рН 7,0-7,2 в течение 31-35 ч с последующим выделением из клеток щелочным гидролизом. Выход 1-2% от С, 3-4% от биомассы. Полисахарид состоит из повторяющихся единиц, содержащих четыре остатка рамнозы и по одному остатку фруктозы и гексуроновой кислоты. Мол.м. - 70000 Д. Митогенная активность 23,75 t 0,75%, митогенный индекс 70,6+0,8.

S

(Л

Изобретение относится к микробиологии и касается нового штамма бактерий GоRYNевастеRIUм SереDоNIсUм ВНИИА N4834 - продуцента полисахарида, обладающего митогенной активностью. Цель - повышение безвредности митогенного препарата и экономичности, а также снижение трудоемкости его получения. Штамм выделен из больных клубней картофеля, хранится на косяках картофельного агара. Полисахарид получают выращиванием культуры на жидкой среде, содержащей глюкозу и хлорид аммония в качестве источников углерода и азота соответственно, при 25±3°С, рН 7,0-7,2 в течение 31-35 с ч последующим выделением из клеток щелочным гидролизом. Выход 1-2% от С, 3-4% от биомассы. Полисахарид состоит из повторяющихся единиц, содержащих четыре остатка рамнозы и по одному остатку фруктозы и гексуроновой кислоты. Мол.м.70000 Д. Митогенная активность 23,75± 0,75%, митогенный индекс 70,6±0,8.

Изобретение относится к микробиологии и касается нового штамма бактерий Corynebacterium sepedonicum - продуцента полисахарида, обладающего митогенной активностью.

Цель изобретения - повышение безвредности митогенного препарата, а также повышение экономичности и сни- жение трудоемкости его получения.

Штамм депонирован в коллекции культур микроорганизмов Всесоюзного научно-исследовательского института

антибиотиков (ВНИИА) под номером 1834. Хранится в Институте микробиологии и вирусологии .К.Заболотно- го АН УССР под номером ИМВ 7737.

Культуру хранят в пробирках на косяках с картофельным агаром. Его состав: 200 г картофеля, 0,5% хлорида I натрия, 1,5-2,0% агара, вода до 1 л, рН 7,0-7,2. Условия хранения: при комнатной температуре или под минеральным маслом.

Штамм выделен из больных клубней ( картофеля. Способ получения штамма состоит в следующем. Пораженную ткань картофеля вырезают, промывают стерильной водой, растирают с небольшим количеством стерильной воды, образующуюся гомогенную кашицу высевают на поверхность агара и выращивают при

25+3 С на одной из следующих питательны ; сред: картофельный агар; картофельный агар +1% глюкозы; картофельный агар 1% дрожжевого авто- лизата; мясопептонный агар (МПА).

Штамм имеет следующие морфологи- ческие и физиолого-биохимические признаки.

Морфологические признаки.

Клетки размером (0,4-0,6)х(0,8- 1,2) мкм, прямые или несколько ис- кривленные палочки, неподвижные, неспороносные. Располагаются одиночно, парами или V-образно. Граммполо- жительные.

На картофельном агаре - колонии круглые, гладкие, нежные, приподняты блестящие, слабо слизистые, желтого цвета. Хорошо растет на обычных питательных средах.

Физиолого-биохимичес1 ие признаки.

Сбраживает ксилозу со слабым обра зованием кислоты. Не образует кислоту из глюкозы, лактозы, мальтозы, сахарозы, рамнозы, маннита,салицита, дульцита, сорбита. Не образует сероводород, индол. Нитраты не редуцирует. Молоко слабо пептонизирует. Желатину не разжижает. Аэробный рост, температура 23-25°С, рН 7,0-7,2. Не вирулентен,, не токсичен для теплокровных животных.

Штамм продуцирует полисахарид с митогенной активностью при выращивании на жидкой синтетической среде содержащей глюкозу в качестве источника углерода и хлорид аммония - в качестве источника азота, при температуре 23-25°С в течение 31-35 ч. Полисахарид накапливается в клетках Его выделяют щелочным гидролизом клеток. Выход полисахарида составля- ,ет 1-2% от источника углерода и 3-4% от биомассы.

Пблисахарид состоит из повторяю- ищхся единиц, содержащих один остаток фруктозы, четыре остатка рамнозы и один остаток гексуроновой кислоты. Мол.мае. 70000 Д„

0

5

0

5

30

35 40

45 50

55

Ниже приведены примеры получения полисахарида с использованием штйм- ма Corynebacterium sepedonicum ВНШ1А № 1834.

Пример 1„ Культуру штамма, хранящуюся на косяках с картофельным агаром, засевают на косяк с той же средой и выращивают в термостате при 23-25 С в течение 24 ч Затем культуру смывают с косяков жидкой питательной средой описанного выше состава и засевают в колбы емкостью 500 мл, содержащие 200 мл питательной среды следующего состава, г/л: MgSO 0,3; KHjPO 3,0; 6,0; NH4.C1 1,0; глюкоза 5,0; рН среды 7,0-7,2. Выращивают на качалках (240 об/мин) в течение 31 ч. Клетки осаждают центрифугированием при 5 000 об/мин в течение 20-25 мин, промывают физиологическим раствором и подвергают гидролизу в 5%-ном растворе КОН (100 мл на 10 г влажных клеток) в течение 1,5 ч. Гидролизат диализуют против водопроводной, а затем дистиллированной воды до нейтрального значения рН, центрифугируют для осаждения неразрушенных клеток, а также загрязняющих компонентов клеточной стенки при 5 000 об/мин в течение 20-25 мин. Полисахарид осаждают из надосадочной жидкости добавлением 5 объемов спирта. Осадок полисахарида освобождают от липидов последовательной обработкой ацетоном, эфиром, а затем смесью хлороформа с метанолом (2:1) и подвергают ионообменной хроматографии на ДЭАЭ-цел- люлозе. Полисахарид элюируют 0,25 М фосфатным буфером с рН 7,2, а затем лиофильно высушивают. Выход очищенного полисахарида составляет 3-4%.

Полученный полисахарид проверяют на митогенную активность в реакции бласттрансформации В-лимфоцитов периферической крови человека.

Учет реакции бласттрансформации лимфоцитов проводят морфологическим методом в фиксированных и окрашенных по Романовскому мазках, в которых просматривают по 200-400 клеток и подсчитывают количество бластных, бластоподобных форм и лимфоцитов.

Митогенная активность полисахарида, синтезируемого С.sepedonicum ВНИИЛ № 1834, составляет 23,75+0,75%, митотический индекс - 70,6+0,8,

51493672б

Формула изобретения- цент полисахарида, обладающего митоШтамм бактерий Corynebacterium генной активностью, sepedonicum ВНИИА № 1834 - проду