Способ получения 5 @ -0-диметокситритилтимидин-3 @ -гидрофосфоната Советский патент 1992 года по МПК C07H19/10 

Изобретение относится к области биоорганической химии, в частности к улучшенному способу получения 5 -0-диметокситритилми- тидин-3 -гидрофосфоната (Dmtr Три).

Указанное соединение используют в качестве мономера для химического синтеза олигонуклеотидов, широко применяющихся в области молекулярной биологии и генной инженерии.

Известен способ получения Dmtr Трн 1, состоящий из 3-х стадий. На первой из них проводят реакцию 5 -0-диметокситритилти- мидина (Dmtr Т) с салицилхлорфосфитом (Sal РС)всмесидиоксан-пиридин при комнатной температуре в течение 10 мин, на второй стадии реакционную смесь обрабатывают водой 5 мин и продукт выделяют известными методами с выходом 88%. Недостатками этого способа являются высокая трудоемкость и излишняя длительность вспомогательных стадий процесса вследствие необходимости получения перед реакцией промежуточного продукта - Sal PCI, коммерчески недоступного и лабильного при хранении а также последующих затруднений при очистке продукта от салициловой кислоты, образующейся на стадии гидролиза.

Наиболее близким к изобретению является способ, состоящий из 4-х стадий 2. На первой стадии получают промежуточный продукт - триимидазолилфосфин реакцией треххлористого фосфора (), имидазола и триэтиламина в ацетонитриле при 0°С в течение 15 мин, на второй стадии полученным продуктом обрабатывают раствор Dmtr Т в ацетонитриле при той же температуре в течение 30 мин, затем смесь гидролизуют 54 мин и продукт выделяют известными методами с выходом 86%.

Недостатками известного способа являются повышенная трудоемкость, излишние длительность и сложность процесса вследствие проведения стадии получения промежуточного триимидазолилфосфина, а также связанных с этим затрат времени на гидролиз реакционной смеси и очистку целевого продукта от больших количеств имидазола, образующегося при этом. Кроме того, высоЈ

Х|

СЛ Ю 00

Јь

N)

кэя стоимость имидззола (500 руб./кг) удорожает целевой продукт.

Целью изобретения является упрощение и ускорение процесса, а также увеличение выхода целевого продукта.

Цель достигается тем, что суспензию 5 -0-диметокситритилтимидина (Dmtr Т) в ацетонитриле обрабатывают РС1з в присутствии низкоосновного третичного амина (рКа меньше 8) при перемешивании. Третичный амин преимущественно выбирают из группы: пиридин, хинолин, 2,6-лутидин, 2,4,6-коллидин, N.N-диметиланилин.

Сущность способа заключается в следующем.

Суспензию Dmtr Т в ацетонитриле обрабатывают при перемешивании и пониженной температуре, преимущественно при 0-(-20)°С в присутствии низкоосновного третичного амина (рКа меньше 8), выбранного из группы: пиридин, хинолин, 2,6-лутидин, 2,4,6- коллидин. Kj.-диметиланилин и т.д., в течение 3-10 мин по схеме DmirO 0ThyB Dwlr04 QTh9

У+РС1 ШйГ V

оно ,ci

(DmlfT)РЧ

Ul

(DmtrTpc,

где Dmtr - диметокситритил; Thy - тимин-1- ил; В - третичный амин.

Затем реакционный продукт гидролизу- ют добавлением водного пиридина при той же температуре в течение 1-2 мин по схеме

Dmt.rO DmlrTpc,2iWX V°J9

S-ГХ -

fDmlrT °

где Ру - пиридин, и выделяют продукт известными методами. Выход целевого продукта составляет 90-92%, затраты времени на основных стадиях процесса 4-12 мин в зависимости от температуры и типа основа- ния.

Существенным отличительным признаком предлагаемого способа является обработка суспензии б -О-диметокситритилтимидина в ацетонитриле треххлористым фосфором в при- сутствии низкоосновного третичного амина.

Применение низкоосновного третичного амина в р«а меньше 8 вместо смеси вторичного и высокоосновного третичнго (рКа 10) аминов в прототипе позволяет, во-пер- вых, избежать стадии перевода активного в менее реакционноспособные производные типа триимидазолилфосфина, что обеспечивает упрощение и ускорение процесса, и, во-вторых, смягчить действие ,

0

5

0

0

5

5

0

5

0

5

предотвращая ее атаку гетероцикла в молекуле Dmtr Т за счет уменьшения ионизации функциональных групп этой части молекулы в присутствии низкоосновного амина.

Использование суспензии Dmtr Т в ацетонитриле (вместо его раствора в том же растворителе) позволяет поддерживать постоянный по ходу реакции избыток по отношению к Dmtr Т, что предотвращает образование побочных димерных продуктов типа (Dmtr TfcPCI и обеспечивает высокий выход целевого продукта.

Изобретение иллюстрируется следую щими примерами.

Пример 1. Синтез б -О-диметокситри- тилтимидин-З -гидрофосфоната в присутствии пиридина. Суспензию Dmtr Т (0,544 г, 1 ммоль) в ацетонитриле (4 мл) и пиридине (0.24 мл, 3 ммоль) обрабатывают (0,16 мл, 1,8 ммоль) при -15°С и перемешивании в течение 10 мин до растворения осадка, раствор гидролизуют смесью вода-пиридин (1:3 по объему, 4 мл) при той же температуре в течение 1 мин при перемешивании, добавляют 1 М раствор триэтиламмонийбикарбо- ната (рН 7,5) (7 мл), встряхивают и экстрагируют хлороформом (3x15 мл). Объединенные экстракты промывают водой (5 мл), сушат сульфатом натрия и после от- фильтровывания осушителя фильтрат упаривают в вакууме, добавив к нему 0,5 мл триэтиламина. Раствор продукта в хлороформе (3 мл) и пиридине (0,1 мл) наносят на колонку с силикагелем (20 г)(ЧСФР, 40-100 мкм) и элюируют продукт ступенчатым градиентом этанола в хлороформе, содержащим 1 % пиридина: 10%, 15%, 20%. 25% (по 50 мл каждого). Продукт собирают (10500 о.е.267), упаривают растворители в вакууме. Остаток растворяют в хлороформе (4 мл) и эфире (2 мл) и выливают в смесь эфир-пен- тан (1:2 по объему, 80 мл). После центрифугирования и высушивания в вакууме над Р205 получают 0,64 г (91 %) Dmtr Трн в виде триэтиламмониевой соли. Продукт гомогенен при ТСХ на силикагеле в системах: хлороформ-этанол (4:1), этанол-хлороформ-1 М ацетат аммония, рН 6 (10:10:1) и изопропа- нол-аммиак-вода (7:1:2), совпадая по Rf с контрольным образцом. УФ-спектр (этанол): Я макс 269 нм (11600) и 234 нм (23000); А мин 255 нм (10000). Содержание Dmtrrpynn, определенное при А макс 500 нм (72000) в смеси этанол-60% НСЮч, составляет 99%.

Пример 2. Синтез 5 -0-диметокситри- тилтимидин-З -гидрофосфоната в присутствии хинолина. Суспензию Dmtr Т (0,544 г, 1 ммоль) в ацетонитриле (4 мл) и хинолине (0.35 мл, 3 ммоль) обрабатывают (0,16

мл, 1,8 ммоль) при -10°С при перемешивании до растворения осадка в течение 10 мин. Далее обработку реакционной смеси проводят, как описано в примере 1. получая 0,65 г (92%) б -О-диметокситритилтимидин- 3 -гидрофосфоната в виде триэтиламмоние- вой соли с такими же характеристиками.

Пример 3. Синтез 5 -0-диметоксит- ритилтимидин-З -гидрофосфоната в присутствии 2,4,4-коллидина. Суспензию Dmtr Т (0,0544 г, 0,1 ммоль) в ацетонитриле(0.4 мл) и 2,4,6-коллидине (0.039 мл, 0,3 ммоль) обрабатывают при 0°С и перемешивании РС1з (0,016 мл, 0,18 ммоль) в течение 4 мин. Густую суспензию (выпадает осадок хлоргидра- та 2,4,6-коллидина) обрабатывают, как описано в примере 1, получая 0,063 г (90%) триэтиламмониевой соли целевого продукта.

Таким образом, способ позволяет увеличить выход целевого продукта на 6% (с 86 до 92%); упростить процесс в результате исключения стадии получения промежуточного продукта триимидазолилфосфина и облегчения процесса очистки целевого продукта; ускорить процесс в 9 раз: снизить себестоимость целевого продукта.

Формула изобретения 1 .Способ получения 5-0: диметокситри- тилтимидин-3-гидрофосфоната путем обработки 5 -0-диметокситритилтимидина в

ацетонитриле треххлористым фосфором в п ри- сутствии амина при пониженной температуре, гидролиза реакционной смеси и выделения целевого продукта, отличающийся тем,что, с целью упрощения и ускорения процесса, а

также повышения выхода целевого продукта, суспензию 5 -0-диметокситритилтимидина обрабатывают треххлористым фосфором в присутствии низкоосновного третичного амина с рКа меньшей.

2. Способ по п. 1,отличающийся тем, что низкоосновный третичный амин выбирают из группы пиридин, хинолин, 2,6-лу- тидин, 2,4,6-коллидин, N.N-диметиланилин.

Использование: в качестве мономера для синтеза олигонуклеотидов. Сущность изобретения: продукт - 5 -0-диметокситри- тилтимидин-31 - гидрофосфонат. БФ С15Н25№ОвР. ВЫХОД 91%. Армяке 269 НМ