Способ получения 4 @ -дезокси-13(S)-дигидро-4 @ -йододоксорубицина Советский патент 1992 года по МПК C12P1/06 C12P1/06 C12R1/465 

ш

N4

Использование: микробиологическая промышленность, производство антибиотиков. Сущность изобретения: для получения 4 -дезокси-13(5)-дигидро-4 -йододоксоруби цина используют штамм Streptomyces peucetlus DSM 2444. Последний выращивают при 27-30°С в течение 3-5 дней в жидкой питательной среде, содержащей источники азота и углерода и минеральные соли, в присутствии 4 -диокси 4 йододоксиоу5ицина в форме его хлоргидрата в конечной концентрации 0,1 мг/мл среды. Полученнуо культу- ральную жидкость разделяют, и отделенный мицелий экстрагируют ацетоном. Жидкую фазу экстрагируют смесью дихлорметана и метанола в объемном соотношении 9:1 при рН 8 0. Полученные экстракты объединяют и концентрируют при пониженном давлении до сухого состояния. Затем концентрат растворяют в дихлорметане и хроматогра- фируют на колонке из силикагеля, забуфе- ренного до рН 7,0. Целевой продукт элюируют последовательно смесью дихлорметана, метанола и воды при объемном соотношении 95:5:0,25 л 90:10:0,5. Второй элюат концентрируют в присутствии Н-про- панола, выделяют целевой продукт и переводят в форму его хлоргидрата. 1 з.п. ф-лы, 2 табл. «« Р.

Изобретение относится к микробиологической промышленности, в частности производству антибиотиков.

Для осуществления способа используют штамм Streptomyces peucetlus M 87 F.I. Штамм получен селекцией путем воздействия на исходный штамм S. peucetlus подвида aureus ATCC 31428 нитрозогуанидином. Штамм зарегистрирован под каталожным номером DSM 2444 в немецкой коллекции микроорганизмов, Западная Германия.

Штамм применяют для стереоселектив- ного восстановления функциональной группы кетона в 13-положении 4 -дезокси-4

-йододоксорубицина:

О ОН

он

QH ОСИ О ОН о

н3с-7-0 7 (I)

, Ј-

NH.

Р Ю 00

сь

W

(О

с получением специфически 4 -дезокси-13- (5)-дигидро-4 -йодоксорубицина, одного из

двух возможных при С-13 стереоизомерных 4 -дезокси-13-дигидро-4 -иододоксорубиц иное. Новое соединение формулы (II) называемое далее как FCE 24883, является полезным в качестве противоопухолевого средства и проявляет активность на экспериментальных опухолях, сравнимую с активностью 4 -дезоксо-4 -иододоксоруби- цина формулы (I). Субстратом для микробно- го стереоселективного восстановления является полусинтетический аналог доксорубицина.

Получают целевой продукт формулы (И);

О ОН О

он

ОСН3

Морфология г утанжого шта i M 37 F.1 не отличается ot таковой мате HI rwo г.тяг , т S nri.cetius ATCC 3 И98, p . &,ef т к-зк I bv; к. четко различаю1 - по сво- . |И гультуральт (ч биохимически- х рак- )0рисп|кам. Так, мутантный шгамм ч F 1 .о продуцирует на агаровой среде oi соло- чеь ;о-/кептого до /шмонио-жt /i ion гво римого пигмента, который явлт тся характерным для мя РОИМО-ого штзггэ 3 peucelius ATCC 31428.

Кроме того, мутангмый илами M 87 F.1. может избирательно превращать сое/жжение (I) в соединение (II), югд как материнский шммм S. peucetius ATCC не избирателен в зтом отношении Оно с ойст- во мутанта М 87 F 1 с«о высоко полезным, как описано в

Счереоизбирательное йиопреобра ова- нче м Гчьпь ос,щесгплень тшожа- ющеися лыури S. peueenus M 87 F.I. поп добавлении соединения d) в качестве субстрата в купьтуряльн.,... (.,vu в инку- баи-ючнсм периоде

Ccit г 4ненпе () може быт- пемэв форме гидрохяорида поело г ЗРЦИИ в стерильной дистиллироааншл чидо. Культуру выращивают в питательной следе, содержащей источник углерода, например усваипасмыи углевод, и источник d3uia, r.e. усваиваемое соединение азота или белковый материал. Предпочтительные источники углерода включают глюкозу, сахарозу, глицерол, крахмал, кукурузный крахмал, декстрин, мелассу и тому подобные. Предпоч

тительные источники азота включают настой от замачивания зерна, дрожжевой экстракт, пивные дрожжи, соевую муку, муку из семян хлопка, кукурузную муку, казеин,

5 рыбную муку, сухие остатки дистилляции, животный пептон, мясной экстракт, соли аммония и др. Может быть выгодно использовано сочетание таких источников углерода и азота.

10Процесс биопревращения может длиться примерно от 72 часов до 8 дней Инкуба- ционная температура в процессе биопревращения может быть в интервале примерно от25°Сдо 37°С, предпочтительно

15 29°С. Содержимое бродильных сосудов аэрируют взбалтыванием при 250 оборотах в минуту или перемешиванием стерилизованным воздухом, чтобы способствовать росту микроорганизма и таким образом

20 повысить оффективность процесса превращения

Ход реакции микробного превращения контоопируют взятием образцов бродильной среды при различных временных интер25 аачзх и экстракцией при рЫ 8,0 смесью ФшюрмсгеЖ-метанол в отношении 9:1. Когда пробу органического экстракта подвергают то ч кос; оймой хроматографии, используя в качестве элюента смесь хлороформа, ме30 грмола, уксусной кислоты и воды о отношении 80:20.7.3 по объему, соединение FCE 24883 (II) появляется при значении Rf среды 0,, тогда как 4-дезо; си-4 йододоксоруби- цп i С) находят при Rf О,GO. Ко in юстгенное

определение двух ачтрс циклиноы г.ожет быть осуществлено то ослоичой хроматографии с упомянутой вмше злюиру- ющей системой, соскабливанигм и внмыва- нием метанолом соответствующих зон

40 красным окраширанием и конечным спектрометрическим определением пр 496 нанометрах,

Весь ферментациоь а и Сулюн, з юто- ром соединение (I) подвергается превраще45 нию в соединение FCE 24883 (II), фильтруют с помощью диатомовой земли. Отфильтрованный красный мицелий экстрагируют смешивающимся с водой органическим растворителем, аким как метанол и дру50 гие низшие гчиргы, диоксан, ацетонитрил и предпочтитет но ацетон. Экстракты г/ицелия собирают, концентрируют пои пониженном давлении и объединяют с профильтрованной ферментационной жидкостью, устанав55 ливают рН 8,0, затем экстрагируют несмешивающимся с водой органическим растворителем, таким как н-бутанол, хлороформ, дихлорметан или предпочтительно смесь дихлорметан-метанол в отношении 9:1. Органические экстракты содержат соединемие FCE 24883 (II) вместе с соединением (I) и небольшими количествами других продуктов разложения.

Органический экстракт концентрируют при пониженном давлении досуха и остаток растворяют в дихлорметане и хроматогра- фируют на колонке силикагеля, стабилизированного буфером с рН 7,0, градиентом смеси дихлорметан-метанол-вода. Соединение () вымывают первым смесью в отношении 95:5:0,25, затем соединение FCE 24883 (1) смесью в отношении 90:10:0,5. Из объединенных фракций после промывки водой, концентрирования до небольших объемов в присутствии н-пропанола, добавления эквивалента хлористоводородной кислоты и избытка н-гексана, получают преципитат чистого FCE 24883 () в виде гидрохлорида (III)

н он

ОСгЪ О

W

Н3С-т0 7

NH, HC1

FCE 24883 (II) как свободное основание растворимо в полярных органических растворителях и водных спиртах, тогда как его гидрохлорид (III) растворим в воде, но мало растворим в органических растворителях. Гидрохлорид соединения СЕ 24883 имеет следующие физико-химические свойства:

Точка плавления: 200°С (разлагается):

удельное вращение а о29 + 188° (с 0,05, метанол).

Спектр поглощения в УФ и видимой области: /We 232, 254, 290 и 480 нанометров (EI% 492, 370, 127. 163);

ИК-спектр (КВг): пики при следующих частотах: 3400, 2970, 2920, 1610, 1580, 1472, 1440, 1410, 1380, 1355, 1320, 1280, 1235, 1210, 1110, 1080, 1060, 1030, 1010,985,965, 940, 920; 900, 890, 870, 860, 830, 810, 785, 755, 730, 710, 540, 480, 450 и 415

Спектр ЯМР на ядрах 1Н (ДМСО-de, 200 МГц, 22°С) млн.д: 14,03 (широкий синглет, 2Н, ОН-б, ОН-11), 7,6-7.0 (м, ЗН, Н-1, Н-2, Н-3), 5,26(м, 1Н, Н-1).4,96(д, J 5,2 Гц, 1Н, ОН-13),4,92(м, 1Н.Н-7), 4,55 (м, 1Н, Н-4),4,51 (т, J 6,7 Гц, 1, ОН-14). 4,20 (с, 1Н, ОН-9). 3,97 (с, ЗН, 4-ОСНз), 3,76 (ддд, J 3,5, 6,7, 11,0 Гц, 1Н, СН(Н)-ОН), 3.60 (д.кв., J 1,0,

6,0 Гц, Н-5), 3,48 (ддд, J 7,2, 6,7. 11.0 Гц, 1Н, СН(Н)-ОН); 3,37 (ддд: J - 5,2, 3,5. 7,2 Гц. 1Н, Н-13), 3,02 (м, 1Н, Н-3), 2,81 (м, 2К, СН2- 10), 2,15(дд, J 2,0, 15,3 Гц. 1Н, Н-8е), 1.97

(дд, J 6,0, 15,3 Гц, 1Н. Н-8 акс). 1.7-1,9 (м, 2Н, СН2-2) и 1,14 (д. J 6,0 Гц). ЗН. СН3-5); молекулярная формула: СгтНзоМю-НС. m/Z в D эквиваленте к свободному основанию: 656 (МН)+; 655 (М) и 410 (, соответствую0 щие агликону.

Селективная жидкостная хроматография высокого давления позволяет разделить (два максимума с временем задержки 18,8 и 10,3 минут) два стереоизомерных

5 спирта приС-13, присутствующих в образце синтетического 4 -дезокси-13-дигидро-4 - иододоксорубицина, полученного восстановлением йода боргидридом натрия.

Используя тот же метод жидкостной

0 хроматографии высокого давления, получают соединение FCE 24883 (II) как отдельный пик с временем задержки 19,3 минуты, соответствующим времени медленно движущемся составляющей синтетического

5 13-дигидропроизводного,

Метод жидкостной хроматографии высокого давления. Колонка: лве секции RP сферисорб S 30DS2 (С18 3/1, разделение фаз Великобритания) размером 150 х 4.5 мм.

0 соединенные в ряд; температура .45СС; мобильная фаза А; 0,05 М водного КНаРСм, подкисленного до рН 3,0 смесью НзРОз-ме- танол в отношении 80:2 по объему; подвижная фаза В: метанол; проявление,

5 изократное за 30 минут (42% А + 58% В); скорость потока 0,6 мл/мин; детектирован е: 254 нанометра,

Кислотный гидролиз соединения (II) (0,2 н. хлористоводородная кислота, 80°С,

0 30 минут) дает красный осадок соответствующего агликона, тогда как сахарная компонента, а именно 3-амино-2,3,4.6-тетраде- зокси-4-иод-Ьликсогексогексоза, присутствует в водной фазе и идентифицирована в

5 сравнении с аутентичный образцом, полученным при кислотном гидролизе соединения ().

Цитотоксическую активность соединения FCE 24883 испытывают in vitro на клет0 ках Helan P 388 в сравнении с соединением (I) и доксорубицином. Выявлено, что соединение (II) не менее активное, чем4 -дезокси- 4 -йододоксорубицин (I) и доксирубицин (табл. 1).

5Активность in vivo соединения FCE

24883 (II) испытывают против рассеянного лейкоза Гросса. Мышам линии СЗН вводят внутривенно инъекцию 2-10° клеток на мышь, обрабатывают соединениями и изучают 24 часа после опухолевой инъекции.

При оптимальной дозе соединение FCE 24883 (II) более активное, чем доксоруби- цин, и такое же активное, как 4 -дезокси-4 - -йододоксорубицин (I), с малой токсичностью, проявленной при активных дозах. Противоопухолевую активность соединения (II), оцененную как среднее время выживания обработанных животных над контрольными мышами, можно сравнить с активностью соединения (I) и доксорубицина (табл, 2).

Способ иллюстрируется следующими примерами.

П р и м е р 1. Культуру микроорганизма Streptomyces peucetius штамм М 87 F.1. (D М 2444) выращивают 14 дней при 28°С на скошенном агаре бледующей поддерживающей среды (Среда А): глюкоза 3%, пивные дрожжи 1,2%; NaCI 0,1%; КНзРСм 0,05%, СаСОз 0,1%; MgSCM 0,005%; FeSCM TI-kO 0,0005%,-ZnS04-7H20 0,0005%; CuS04 5H20 0,0005%; агар 2%, водопроводная вода до 100 мл, рН 0,7. Стерилизацию проводят нагреванием в автоклаве в течение 20 минут.

Споры выращенной культуры собирают и суспендируют в 3 мл стерильной дистиллированной воды. Этой суспензией засевают 60 мл жидкой питательной среды, содержащейся в 300 мл колбах Эрленмейе- ра: пивные дрожжи 0,3%, пептон 0,5%, Сз(МОз) 4Н20 0,05%, водбпроводная вода до 100 мл. Стерилизацию проводят нагреванием в автоклаве при 120°С в течение 20 минут, рН этой среды после стерилизации устанавливают между 6,8 и 7,0. Инокулиро- ванные колбы встряхивают два дня при температуре 28°С на роторной мешалке при 250 об/мин, описывающей окружность диаметром 7 см. 1,5 мл культуры, выращенной описанным способом, высевают в 300 мл колбы Эрленмейера, содержащие 50 мл следующей биотрансформирующей среды: дрожжевой экстракт 1,5%, К2РСМ 0,25%, глюкоза 1.5%, водопроводная вода до 100 мл, рН 6,9. Стерилизацию проводят нагреванием в автоклаве при 115°С в течение 20 минут. Раствор глюкозы стерилизуют отдельно и добавляют к каждой стерилизованной колбе в нужной концентрации.

Затем содержимое колб инкубируют при 28°С в условиях, описанных для фазы посева, в течение 24 часов. В это время в каждую колбу добавляют по 1,0 мл раствора соединения (I) в стерилизованной воде в концентрации 5 мг/мл. Встряхиваемые колбы инкубируют еще два дня и получают 70%-ое превращение соединения (I) в соединение (II).

П р и м е р 2. Культуру микроорганизма S. peucetius штамм М 87 F.1. выращивают

на твердой питательной среде, как описано в примере 1. Споры трех скошенных агаров объединяют и собирают в 10 мл стерильной дистиллированной воды. Полученную таким

образом суспензию высевают в 2-х л опрокидывающиеся колбы с круглым дном, содержащие 500 мл посевной среды, описанной в примере 1. Колбу инкубируют 48 часов на роторной мешалке, вращающейся

0 со скоростью 120 об/мин и описывающей окружность диаметром 7 см, при температуре 28°С. Весь посевной материал инокулиру- ют в 10 л бродильный чан из нержавеющей стали, содержащий 7,5 л биотрансформиру5 ющей среды, описанной в примере 1 и стерилизованной водяным паром при 120°С в течение 30 минут. Раствор глюкозы стерилизуют отдельно и добавляют в стерилизованный бродильный чан в соответствующей

0 концентрации. Культуру выращивают при 28°С при помешивании с 230 об/мин и аэрации потоком воздуха со скоростью 1 л/л среды/мин. Через 48 часов добавляют субстратное соединение в концентрации,

5 описанной в примере 1, и после инкубирования культуры в течение 3-х дней получают 60%-ную конверсию соединения (I) в соединение (II).

П р и м е р 3. Цельное сусло (5 л) из

0 ферментации, полученной по примеру 2, фильтруют с использованием 2% диатомовой земли в качестве фильтра. Влажный осадок на фильтре экстрагируют ацетоном (3 л). После фильтрации проводят две дополни5 тельных экстракции ацетоном для достижения полного выделения красных пигментов. Объединенные ацетоновые экстракты концентрируют при пониженном давлении и концентрат (1 л) объединяют с профильт0 рованным бульоном и исчерпывающе экстрагируют при рН 8,0 смесью дихлорме- тан-метанол в отношении 9:1. Органический экстракт, содержащий соединения (i) и (II) с теми же продуктами распада, концентриру5 ют досуха при пониженном давлении. Остаток, растворенный в дихлорметане, хроматографируют на колонке силикагеля, стабилизированного буфером с рН 7,0 (М/15 фосфатный буфер), градиентом смеси

0 дихлорметан-метанол-вода. После вымывания некоторых продуктов распада элюиру- ют соединение I смесью в отношении 95:5:0,25 с последующим элюированием соединения FCE 24883 (II) смесью в отноше5 нии 90:10:0,5

Из объединенных фракций после промывки водой, концентрации до небольшого объема в присутствии н-пропанолз, добавления одного эквивалента хлористоводородной кислоты и избытка н-гексана

получают чистое соединение FCE 24883 (II) 0,30,60%-ный выход, в форме гидрохлорида (т.пл. 200°С, разлагается). Повторяя процесс, выделяют также нетрансформированное соединение I (0.13 г, 26%) в виде гидрохлорида.

П р и м е р 4. Образец соединения FCE 24883 (II) 200 мг растворяют Р 0,2 н. водной хлористоводородной кислоте (50 мл) и нагревают 30 минут при 100ЭС. Кристаллический красный осадок (0,12 г) агликона собирают фильтрацией, промывают водой и сушат. Масс-спектр: т/е 416 (М4). Агликон идентифицирован как 13-(3)-дигидроадриа- мицинон сравнением с аутентичным образцом.

рмула изобретения 1. Способ получения 4 -дезокси-13(5)- дигидро-4 -йододоксорубмцина формулы

О ОН

ОСИ

In vitro активность 13-/5/-дигидро-4 -йододоксируоицина (соединение II, FCE 24883) в сравнении с 4 -дезокси-4 -йододоксирубицином (соединение I, FCE 21954) и

доксорубицином (Дх)

a)доза, дающая 50% снижение числа клеток в сравнении с контрольными необработанными животными

b)клетки зпителиоидной карциномы шеи человека

c)Р388 - лейкозные клетки

0

5

0

5

заключающийся в том. что штамм Streptomycps peucetius DSM 2444 культивируют в аэробных условиях в питательной среде, содержащей источники азота и углерода и минеральные соли, в присутствии 4 -дезокси-4 -йододоксирубицина в форме его хлоргидрата в конечной концентрации 0,1 мг/мл среды при температуре 27-30°С, полученную культуральную жидкость разделяют, отделенный мицелий экстрагируют ацетоном, а жидкую фазу смесью дихлорме- танз и метанола в объемном соотношении 9:1 при рН 8,0, далее полученные экстрайты объединяют и концентрируют при пониженном давлении до сухого состояния, затем концентрат растворяют в дихлорме- гаке и хрсматографируют на колонке из си- ликагеля, забуференного до рН 7,0, злкжруют последовательно смесью дих- лорметана, метанола и воды при объемном соотношении 95:5:0,25 и 90:10:0,5 соответственно, полученный второй злюят концентрируют в присутствии н-пропанола, выделяют целевой продукт и переводят в форму em хлоргидрзта.

Таблица 1

Таблица 2

Активность 13-/5/-дигидро-4 -йододоксирубицина (соединение II, FCE 24883) в сравнении с 4 -деэокси-4 -йододоксирубицином (соединение I, РСЕ21954)и доксорубицином (Дх)

против рассеянного лейкоза Гросса

a)Мышей линии СЗН иньекцировэли внутривенно 2x106 лейкозных клеток и обрабатывали внутривенно соединениями через один день после опухолевой инъекции.

b)(Среднее время выживания обработанных мышей/среднее время выживания контрольных животных) х 100.

c)оценено по результатам вскрытия погибших мышей.