СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ЭТАНОЛА В ОРГАНИЗМЕ ЧЕЛОВЕКА Российский патент 1997 года по МПК G01N33/48 

Изобретение относится к области судебной медицины и может быть использовано для качественного определения этанола в крови человека, например, с целью диагностики алкогольного опьянения лиц, с алкогольным отравлением или совершивших то или иное преступление.

Используемые на практике качественные пробы на этиловый спирт при подозрении на алкогольное опьянение являются неспецифичными.

Проба Мохова и Шинкаренко основана на использовании индикаторных трубок. Под действием паров этанола происходит восстановление ионов хрома, и оранжевая окраска реагента меняется на зеленую или голубую. Однако положительный результат может быть получен также при действии на реагент паров метилового спирта, ацетата, эфира, альдегидов и других веществ.

Проба Рапопорта основана на растворении в дистиллированной воде этилового спирта, содержащегося в выдыхаемом воздухе, и последующем его окислении перманганатом калия в присутствии серной кислоты. При этом происходит изменение окраски раствора. Эта проба также неспецифична, так как положительный результат при ее применении может быть получен при растворении в воде паров эфира, ацетона, бензина, метилового спирта, сероводорода.

Проба Никлу основана на изменении окраски мочи с оранжевой на зеленую после последующего добавления кристаллического перманганата калия и концентрированной серной кислоты. Проба также неспецифична, так как дает положительные результаты в случае присутствия в моче ацетона, метилового спирта и других веществ (БМЭ. М. Cоветская энциклопедия. 1986, изд.третье, т.28, с. 1101-1102).

Задача изобретения достижение специфической, чувствительной и технически простой индикации этилового спирта в организме.

Сущность способа заключается в использовании для индикации этанола в организме реакции между лимфоцитами крови человека, выпившего этиловый спирт, и этаноловым эритроцитарным диагностикумом. Обнаружение в крови обследуемого в 2,5 и более раза повышенного числа "этаноловых" розеток по сравнению с контрольными данными (число "этаноловых" розеток в крови лиц, не употребляющих алкоголь) свидетельствуют о наличии экзогенного этанола в крови и дает основание констатировать употребление этанола обследуемым лицом.

Существенные признаки способа:
ограничительные определение этанола в организме путем исследования биологического материала;
отличительные признаки использование в качестве биологического материала лимфоцитов крови исследуемого лица, к которым добавляют равное количество этанолового диагностикума, смесь инкубируют при температуре 37-37,5^oC и при обнаружении в крови увеличения числа этаноловых розеткообразующих лимфоцитов не менее чем в 2,5 раза по сравнению с нормой, определют наличие этанола в организме человека.

Причинно-следственная связь между совокупностью существенных признаков и достигаемых техническим результатом повышение специфичности способа заключается в том, что с этаноловым эритроцитарным диагностикумом будут взаимодействовать лимфоциты, несущие на мембране рецепторы к этанолу, но не к другим химическим соединениям.

Способ осуществляется следующим образом.

Из пальца забирают 0,1-0,2 мл в пробирку крови, содержащую 20 ед/мл 0,1 мл гепарина (20 ед/мл), добавляют 2 мл дистиллированной воды, через 30 с восстанавливают изотоничность раствора добавлением 2 мл 1,8% хлористого натрия. Суспензию центрифугируют при 1000 об/мин 5 мин, надосадочную жидкость сливают, осадок промывают еще раз средой 199, после чего к осадку добавляют 0,1 мл 1% этанолспефицического диагностикума (глютаровые эритроциты, обработанные танином и этанолом). Смесь выдерживают 15 мин при 37-37,5^oC и 1 ч в холодильнике, после чего оттягивают надосадочную жидкость, осадок ресуспендируют в капле бычьей сыворотки и готовят мазок, который высушивают на воздухе, фиксируют в течение 60 мин в 96^o этиловом спирте и окрашивают по Романовскому-Гимза, затем микроскопируют под иммерсией. Подсчитывают среди 100 лимфоцитов процент клеток, фиксировавших на мембране 3 и более эритроцита.

Способ приготовления этанолового диагностикума.

Готовят глутаровые эритроциты, разведенные до 5%-ой концентрации фосфатно-солевым буфером с HCl, pH 5,8 соединяют их с равным объемом 0,1% раствора этанола, приготовленного на этом же буфере, выдерживают 1 ч в термостате при 37^oC, центрифугируют при 1 т об/мин 5 мин, сливают надосадочную жидкость и готовят 5% эритроциты на фосфатно-солевом буфере с pH 7,2, содержащем 0,1% этанола, соединяют их с раствором танина 1:20 тыс (буфер то же), выдерживают 30 мин при 37^oC, центрифугируют, сливают надосадочную жидкость и отмывают 2 раза буфером 7,2. Затем снова готовят 5%-ные эритроциты на фосфатно-солевом буфере pH 6,4, добавляют равный объем 0,2% раствора альбумина человека, выдерживают 30 мин при 37^oC, центрифугируют и отмывают 2 раза буфером 7,2. Готовят 10% эритроциты на буфере 7,2. Для длительного хранения добавляем мертиолят в концентрации 1:10000.

Результаты проведенных исследований одной группы лиц представлены в таблице.

Результаты исследования показали, что в крови людей, выпивших 50 мл 33% раствора этанола, увеличивается число сенсибилизированных к этиловому спирту лимфоцитов крови, способных взаимодействовать с бараньими эритроцитами, нагруженными этанолом (этаноловый диагностикум) с образованием морфологических структур "этаноловых" розеток. Число розеток в крови выпивших превышало исходное число (до приема алкоголя) в 2,4-8-68 раз уже через 60 мин после приема этанола. Оно оставалось на протяжении 24 ч, т.е. всего периода наблюдения.

Технический результат от использования способа заключается в том, что он дает возможность установить косвенным способом наличие принятого извне этанола в ранние сроки через 60 мин после приема, причем сенсибилизированные этанолом лимфоциты циркулируют в крови и через сутки. Способ высокочувствителен, специфичен, отличается простотой технического исполнения, не требует сложной аппаратуры и высокоспециализированного персонала. Способ может быть осуществлен в клинической лаборатории любой больницы, не имеющей газового хроматографа. Не менее важно и то, что мазок крови, будучи зафиксирован, сохраняется в течение нескольких лет в качестве вещественного доказательства. Кроме того, возможна его транспортировка. Способ может быть использован при освидетельствовании для установления наличия алкогольного опьянения.

Примеры конкретного выполнения.

Пример 1. Обследован практически здоровый донор Ял-ва, употребляющий спиртные напитки крайне редко. Кровь в количестве 0,1-0,2 мл забиралась из пальца обследуемого в пробирку с гепарином (20 ед/мл) до, через 60 мин и через 24 ч после приема им внутрь 50 мл 33% раствора этанола. Добавляли 2 мл дистиллированной воды, через 30 мин восстанавливали изотоничность раствора добавлением 2 мл 1,8% хлористого натрия. Суспензию центрифугировали при 1000 об/мин 5 мин, надосадочную жидкость сливали, осадок промывали еще раз средой 199, после чего к осадку добавляли 0,1 мл 1% этанолспецифического диагностикума. Смесь выдерживали 15 мин при 37^oC и 1 ч в холодильнике, после чего оттягивали надосадочную жидкость, осадок ресуспендировали в капле бычьей сыворотки и готовили мазок, который высушивали на воздухе, фиксировали в течение 60 мин в 96^o этиловом спирте и окрашивали по Романовскому-Гимза, затем микроскопировали под иммерсией. Подсчитывали среди 100 лимфоцитов процент клеток, фиксировавших на мембране 3 и более эритроцитов.

Заключение: через 60 мин после приема алкоголя в крови обследованного в 8 раз по сравнению с исходным увеличивалось число "этаноловых" розеток, оставаясь повышенным в 7,1 раза к 24 ч наблюдения. Эти данные говорят о приеме донором этилового спирта.

Пример 2. Обследован практически здоровый донор Шил-ва. Кровь в количестве 0,1 мл забиралась из пальца обследуемого в пробирку с гепарином (20 ед/мл) до, через 60 мин после приема им внутрь 50 мл 33% раствора этанола. Добавляли 2 мл дистиллированной воды, через 30 мин восстанавливали изотоничность раствора добавлением 2 мл 1,8% хлористого натрия. Суспензию центрифугировали при 1000 об/мин 5 мин, надосадочную жидкость сливали, осадок промывали еще раз средой 199, после чего к осадку добавляли 0,1 мл 1% этанолспецифического диагностикума. Смесь выдерживали 15 мин при 37,5^oC и 1 ч в холодильнике, после чего оттягивали надосадочную жидкость, осадок ресуспендировали в капле бычьей сыворотки и готовили мазок, который высушивали на воздухе, фиксировали в течение 60 мин 96^o этиловым спиртом и окрашивали по Романовскому-Гимза, затем микроскопировали под иммерсией. Подсчитывали среди 100 лимфоцитов процент клеток, фиксировавших на мембране 3 и более эритроцитов.

Заключение: через 60 мин после приема алкоголя в крови обследованного в 68 раз увеличилось число "этаноловых" розеток. Эти данные говорят о приеме донором этилового спирта.

Пример 3. Обследован практически здоровый донор Худ-их. Кровь в количестве 0,1 мл забиралась из пальца обследуемого в пробирку с гепарином (20 ед/мл) до и через 60 мин. Добавляли 2 мл дистиллированной воды, через 30 мин восстанавливали изотоничность раствора добавлением 2 мл 1,8% хлористого натрия. Суспензию центрифугировали при 1000 об/мин 5 мин, надосадочную жидкость сливали, осадок промывали еще раз средой 199, после чего к осадку добавляли 0,1 мл 1% этанолспецифического диагностикума. Смесь выдерживали 15 мин при 37,5^oC и 1 ч в холодильнике, после чего оттягивали надосадочную жидкость, осадок ресуспендировали в капле бычьей сыворотки и готовили мазок, который высушивали на воздухе, фиксировали в течение 60 мин в 96^o этиловом спирте и окрашивали по Романовскому-Гимза, затем микроскопировали под иммерсией. Подсчитывали среди 100 лимфоцитов процент клеток, фиксировавших на мембране 3 и более эритроцитов.

Заключение: через 60 мин после первого забора крови число "этаноловых" розеток практически не изменилось (исходный уровень 6% после вторичного забора 5% ), следовательно этанол не обнаружен в организме человека. Эти данные говорят о том, что если человек не употреблял этиловый спирт, то количество "этаноловых" РОК не меняется.

Использование: в медицине, в частности в области судебной медицины. Сущность способа: исследуют периферическую кровь пациента, из которой выделяют лимфоциты, добавляют к ним равное количество эритроцитарного этанолового диагностикума, смесь инкубируют при температуре 37-37,5^oC, выдерживают в холодильнике, в осадке с помощью микроскопирования определяют количество розеткообразующих лимфоцитов и при их увеличении относительно нормы определяют наличие этанола в организме человека. 1 табл.

Способ определения этанола в организме человека путем исследования биологического материала, отличающийся тем, что исследуют периферическую кровь пациента, из которой выделяют лимфоциты, добавляют к ним равное количество эритроцитарного этанолового диагностикума, смесь инкубуруют при 37,0 - 37,5^oС выдерживают в течение 1 ч в холодильнике, из осадка готовят мазок и с помощью его микроскопирования определяют количество розеткообразующих лимфоцитов и при увеличении их не менее чем в 2,5 раза относительно нормы определяют наличие этанола в организме человека.