Способ получения эхинококкового диагностикума Советский патент 1992 года по МПК G01N33/53 A61K39/00 

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к производству препаратов для серологической диагностики эхинокок- коза у людей и с/х животных.

Наиболее близким является способ получения эхинококкового диагностикума для Ифа (авт.св. СССР № 1363564 А1, А 61 К 39/00, G 01 N 33/53, 1985). Способ включает в себя сбор жидкости из эхинококковых пузырей зараженных овец, ее концентрирование на лиофильной установке, замораживание-оттаивание, центрифугирование и фракционирование надосадочной жидкости комбинацией гель- фильтрации на сефадексе (от Г-50 до Г-200)

и ионообменной хроматографии на ДЕАЕ- сефадексе А-50. Иммунологически активные фракции, полученные таким способом, не содержат мешающих проведению ИФ реакции перекрестно-реагирующих антигенов.

Цель изобретения - повышение точности диагностики эхинококкоза в РИГА.

Цель достигается путем выделения собственно паразитарных, практически не содержащих белков хозяина и перекрестно- реагирующих антигенов паразитарного происхождения, обусловливающих неспецифичность реакции.

Для этого неустойчивые компоненты эхинококковой жидкости овец в процесе ее

XI ON СО

чэ

00

ел

замораживания, оттаивания, концентрирования (лиофилизированную эхинококковую жидкость растворяют в физ. растворе из расчета 0,1-0,2 г лиофилизата на 1,2-2,4 г физ.раствора), выпадают в осадок и удаля- ются центрифугированием (20-30 мин при 6000-8000 об/мин), а супернатант фракционируют проведением аналитического гель- электрофореза. Выделение целевого продукта с йюл.массой 330 кд и более осу- ществляют методом препаративного гель- электрофореза с использованием 10%-ного додецилсульфата натрия (при этом используют гель 7,5%-ной концентрации). Элюиро- вание белка проводят 5 мМ NaHCOs.

Изобретение иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1. Выполнение способа.

Проводят сбор жидкости из эхинококковых пузырей зараженных овец, после замо- раживания и оттаивания жидкость лиофилизируют в течение 22-24 ч (время необходимое для полного высыхания эхинококковой жидкости). Лиофилизат в дальнейшем растворяют в физиологическом растворе из расчета 0,1-0,2 г на 1,2-2,4 гфиз. раствора, после чего концентрат центрифугируют 20-30 мин при 6000-8000 об/мин осадок отбрасывают, а супернатант фракционируют методом гель-электрофореза с ис- пользованием 10%-ного додецилсульфата натрия. Количество материала, фракционируемого в одном опыте, составляет до 10мг белка на 1 см поверхности геля. При проведении препаративного гель-электрофореза используют 7,5%-ную конечную концентрацию акриламида для разделяющего геля. При анализе белкового спектра эхинококковой жидкости выявляют 8 основных белковых фракций с мол.массой от 14 кддоЗЗО кд и более. Фракции выделяют путем элюиро- еания 5 мМ ЫаНСОз, содержащего 0,1%- ный додецилсульфат натрия. Для полной элюции выдерживают кусочек геля в этом растворе при перемешивании 12ч при37°С. От геля освобождаются путем продавлива- ния через шприц с владипором NS 5. В каждой выделенной таким образом фракции определяют содержание белка методом Ло- ури и сорбируют на эритроцитах барана по общепринятой методике.

Пример 2. Определение оптимального времени, необходимого для полного высыхания эхинококковой жидкости и эхинококковых оболочек приведено в табл.1.

Из таблицы видно, что сушка эхинококковой жидкости менее 22 ч недостаточна, так как не происходит полного высыхания препарата, также нет смысла сушить более

24 ч, ибо 24 ч достаточно для полного высыхания эхинококковой жидкости.

Пример 3, Подбор оптимального количества физ. раствора и лиофилизата, необходимого для получения требуемой концентрации белка в растворе и достаточно полного растворения лиофилизата, приведен в табл.2.

Количество материала, фракционируемого в одном опыте, должно составлять 0,1-0,2 г, а минимальное количество физ. раствора, в котором достаточно полно растворяется лиофилизат, составляет 1,2-2,4 г. Концентрат при этом содержит необходимую для фореза концентрацию белка - 9-10 мг.

Пример 4. Параметры очистки концентрата от неустойчивых компонентов эхинококковой жидкости центрифугированием приведены в табл.3.

Из таблицы видно, что оптимальными параметрами центрифугирования, при которых происходит 100%-нак очистка от неустойчивых компонентов эхинококковой жидкости, является 20-30 мин при 6-8 тыс. об/мин.

Пример 5. Иммунологическую активность каждой фракции проверяют в РИГА (табл.4).

Результаты РИГА с эхинококковыми сыворотками показывают, что фракции с мол.массой ниже 100 кд являются непригодными в качестве диагностикума, тогда как фракции, злюируемые с мол.массой 330 кд и более, обладают точностью диагностики. Иммунологически активные компоненты эхинококковой жидкости распределяются в 1 фракции. РТПГА в концентрации Аг 10 мкг/мл 1 фр. затормозила на 5 разведений (снижала титр от 40960 до 2560).

Чувствительность и специфичность диагностикума на основе 1 фр. определяют в РИГА путем сопоставления данных РИГА с коммерческим диагностикумом, полученных при исследовании сывороток крови больных различными паразитарными заболеваниями (аскаридоз, трихинеллез, ге- у.инолепидоз) табл.5, 6.

Таким образом, наиболее чувствительным и специфичным диагностикумом в РИГА при эхинококкозе является часть полученной методом препаративного гель- электрофореза высокомолекулярной фракции эхинококковой жидкости (330 кд и более).

В полученном данным способом препарате не содержится белков хозяина (овцы), поэтому он может быть применен в качестве

универсального диагностикума при эхино- коккозе животных и человека.

Формула изобретения

Способ получения эхинококкового диагностикума, включающий сбор жидкости из эхинококковых пузырей овец, ее концентрирование лиофилизацией, замораживание-оттаивание, центрифугирование и фракционирование антигена из суперна- танта, отличающийся тем, что, с целью повышения чувствительности и специфичности диагностикума, лиофилизацию проводят после замораживания-оттаивания до полного удаления воды, полученный лио- филизат растворяют в физиологическом

растворе при массовом соотношении 0,1- 0,2:1,2-2,4, центрифугирование осуществляют при 6-8 тыс.об/мин в течение 20-30 мин, а фракционирование ведут гель-электрофорезом с использованием

10% додецилсульфата натрия и элюиру- ют антиген с мол.м. 330 кД 5 мМ раствором бикарбоната натрия с 0,1% додецилсульфатом натрия.

Использование: биотехнология, производство препаратов для серологической диагностики эхинококоза у людей и с/х животных, с целью повышения чувствительности и специфичности диагностикума. Сущность изобретения: для повышения точности диагностики выделяют собственно паразитарные антигены, практически не содержащие белки хозяина и перекрестно- реагирующих антигенов паразитарного происхождения, обусловливающих неспецифичность реакции. Способ включает сбор жидкости из эхинококковых пузырей овец, ее концентрирование лиофилизацией, замораживание-оттаивание, центрифугирование и фракционирование антигена из супернатанта. Лиофилизацию проводят после замораживания-оттаивания до полного удаления воды, полученный лиофилизат растворяют в физиологическом растворе при весовом соотношении 0,1-0,2:1,2-2,4, центрифугирование осуществляют при 6-8 тыс.об/мин в течение 20-30 мин, а фракционирование ведут гель-электрофорезом с использованием 10%-ного додецилсульфата натрия и элюируют антиген с молекулярной массой 300 kg 5 мМ растворов бикарбоната натрия с 0,1 %-ным додецилсульфатом натрия. СО

Таблица 2

Таблица 5

Результаты сравнительного изучения чувствительности диагностикума на основе очищенной 1 белковой

фракции, мол. масса которой 330 кд и более

Таблица 6

Результаты сравнительного изучения специфичности диагностикума на основе очищенной 1 белковой фракции, мол. масса которой 330 кд и более

Таблица 3

Таблица 4