Штамм гибридных культивируемых клеток животных MUS мUSсULUS L.-продуцент моноклонального антитела к С-концевому участку А @ - цепи фибриногена человека Советский патент 1991 года по МПК C12N5/18 C12P21/08 

1

(21)4663268/13

(22)20.03.89

(46) 23.08.91. Бкш. № 31

(71)Всесоюзный кардиологический научный центр

(72)Г.П.Самохин, О.В.Иитькевич, З.А.Стрельцова, Т.Н.Власик, Г.Ф.Калантаров и И.Н.Трахт

(53)578.085.23(088.8)

(56)Thurlow P.I.,Connellan I.M., Kenneally D.A. - Thrombosis Res., 1987, 47, p. 427-439.

(54)ШТАММ ГИБРИДНЫХ КУЛЬТИВИРУЕМЫХ КЛЕТОК ЖИВОТНЫХ 11US MUSCULUS L. - ПРОДУЦЕНТ МОНОКЛОНАЛЬНОГО АНТИТЕЛА

К С-КОНЦЕВОМУ УЧАСТКУ Ао(-ЦЕПИ ФИБРИНОГЕНА ЧЕЛОВЕКА

(57)Изобретение относится к гибридом- ной технологии и может быть использовано для определения содержания Ъиб- риногена в плазме крови человека.

Цель изобретения - получение штамма гибридомы, продуцирующей ПонАТ, взаимодействующие с Фибриногеном, но не взаимодействующие с продуктами его деградации под действием плазмина. Штамм получают гибридизацией клеток миеломы Х63 Ag8.653 с клетками селезенки и мышей ВАЬЗ/с, иммунизированных частично очищенными гЬрагментами Либриногена. Штамм культивируют в среде RPMI 1640 с 10% сыворотки эмбриона коровы, 4 мМ L-глутамина, 0,05 мМ меркаптоэтанола и антибиотиками, в ат- мосАере с 5% СО. Штамм прививается в брюшную полость сингенных мышей. МонАТ относится к субклассу IgGl. СпециЛич- с ность связывания с Аб -цепью Либриноге- ™ на определена методами твердофазного иммуноферментного анализа и иммуно- блоттинга. Штамм депонирован под номером ВСКК (II) № 323D.

(Л

Изобретение относится к гибридомной технологии и может быть использовано для определения содержания фибриногена в плазме крови человека. Цель изобретения - получение штамма гибридомы, продуцирующей монАТ, взаимодействующие с фибриногеном, но не взаимодействующие с продуктами его деградации под действием плазмина. Штамм получают гибридизацией клеток миеломы X63, AG8.653 с клетками селезенки и мышей BALB/C, иммунизированных частично очищенными фрагментами фибриногена. Штамм культивируют в среде RPMI 1640 с 10% сыворотки эмбриона коровы, 4 мМ L - глутамина, 0,05 мМ меркаптоэтанола и антибиотиками, в атмосфере с 5% CO₂. Штамм прививается в брюшную полость сингенных мышей. МонАТ относится к субклассу IGGI. Специфичность связывания с А α - целью фибриногена определена методами твердофазного иммуноферментного анализа и иммуноблоттинга. Штамм депонирован под номером ВСКК (П) N 323 D.

Изобретение относится к гибридом- ной технологии и может быть использовано для определения содержания фибриногена в плазме кропи человека.

Цель изобретения - получение штамма гибридомы, продуцирующей МонАТ, взаимодействующие с Фибриногеном, но не взаимодействующие с продуктами его деградации под действием плазмина.

Штамм гибридомы 5А2 ВСКК (II) ff 323D получают следующим образом.

Мышей линии BALB/c иммунизируют внутрибрюшинным введением 100 мкг препарата частично очищенных бромциано- вых Фрагментов Фибриногена человека

(фракция от 20 до 70 кД) в 0,5 мл физиологического раствора, забуЛеренно- го Лоспатами (ЗФР) (5 мМ Na - (Ъосбат- ный буйер; рН 7,2 - 7,4; 150 мМГаС), в полном адъюванте Фрейнда. Иммунизацию повторяют через 23 дня, вводя внутрибрюшинно 100 мкг того же препа рата в ЗФР без адъюванта. Через три дня после этого 1x10 клеток селезенки иммунных мышей гибридизируют с 6х хЮ клеток миеломы мыши X63-Ag 8.653 с помощью 0,4 мл 45%-ного раствора полиэтиленгликоля (ПЭГ) мол.массы 2000, содержащего 10% диметилсульф- оксида, в течение 1 мин. После гибриО1

о

00

J

днзацци и отмынки кчггок от 1Г)Г клет- ки BMcoii.V vr в ЧГ-))Чтле панели по 2x10 клеток в лунку. Для культивирования и гг текции гибридов используют среду ЧРМ1-1 640 г доставлением 10% лошадиной и 10 телячьей эмбриональной

л

сыворотки, 10 М гипоксантина, 4х хЮ М ампноптерина и 1,6x10 II тими- дина. ГМбриды-продуценты клонируют 2 раза методом предельных разведений, высевая по 1 клетке в лунку, содержащую 4x10 клеток селезенки. После двух клонирований практически 100%

Для полумения препарата МонАт в ко личестве, необходимом для проведения иммунохимических исследований, асцит- ную жидкость освобождают от клеток центрифугированием и добавляют сульфат натрия до конечной концентрации 18%. Осадок отделяют центрифугированием, растворяют в 0,02 М

субклонов продуцируют антитела к Фиб- 15 (рн 8,0) и диализуют против этого же

35

риногену. Продукция антител сохраняется как минимум в течение 40 пассажей в культуре.

Ытамм характеризуется следующими свойствами.20

Среда для культивирования - среда RP11I-1640 с добавлением 10% телячьей эмбриональной сыворотки,4 мМ L-глю- тамина, 100 мкг/мл пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина и 0,05 мМ 25 меркаптоэтанола при 37 С в атмосфере 5% углекислоты.

Посевная доза - 10 клеток в 1 мл. Через 3-4 дня концентрация антитела в культуралыюй жидкости достигает 30 20 - 30 мкг/мл. Контдминация бактериями, грибками и микоплазмой не обнаружена. Для длительного хранения гиб- ридомные клетки морозят в эмбриональной телячьей сыворотке с добавлением 10% диметилсульфоксида. Режим замораживания - 4°С в 1 мин до +4 С, а затем - 1°С в 1 мин до -40°С, после чего клетки переносят в жидкий азот. Клетки размораживают, перенося ампулу 40 из жидкого азота в водяную баню на +37°С.

Для выращивания гибридомного штамма в асцитной форме клетки вводят внутрибркмшшно мышам BALB/c, обрабо- 45 тайным пристанем, в количестве 2 - 5x10 клеток на мыть. Асцит созревает через 12 - 14 дней. Секреция МонАт гибридомным штаммом сохраняется на i протяжении 3 пассажей в асцитнон фор- 50 ме. МонАТ, продуцируемое клетками штамма 5А2, относится к 1р,О1-под- классу и связывается с эпитопом, расположенным в С-кониевом участке А&б-це- пн Фибриногена человека.сг

Специфичность взаимодействия МонАТ определяют способом, при котором в качестве антигенов испольяуют Фибриноген человека или его фрагменты,

бубера. После диализа раствор наносят на колонку 16x200 мм с DEAE-Toyopearl 650 И, уравновешенную тем же буфером. Антитела элюируют линейным градиентом NaH2P04 (рН 8,0 - 1 10 - 160 мМ) . Иммуноглобулины класса IgGl элюируют в интервале 60 - 30 мМ, чистота препа рата по данным электрофореза в поли- акриламидном геле составляет не менее 95%.

Тестирование специфичности взаимодействия МонАТ с антигенами методом твердофазного иммуноферментного анализа.

На полихлорвиниловую 96-ячеечную панель (Flow) для микротитрования сорбируют антиген - 2 мкг на ячейку в 50 мкл ЗФР при 4° С в течение ночи. После этого в ячейках панели в течение 1 ч инкубируют по 200 мкл раствора казеина (2 мг/мл), содержащего 0,1% твин-20 в ЗФР, для уменьшения неспецифического связывания антител с пластиком. Затем в ячейки вносят по 50 мкл раствора антител 5А2 в 0,05 М трис-буфере (рН 7,4), содержащем 0,15 М МаС1 и 2- мг/мл казеина, и инкубируют 1 ч при 20°С.

После этого панель отмывают 3 раза струей воды и вносят по 50 мкл раство ра конъюгата щелочной фосфатазы с антителами кролика против иммуноглобулинов мыши, разведенного в 1000 раз тем же буфером, и инкубируют в течение I ч. После 3-кратной промывки в ячейки вносят по 100 мкл раствора п-нитрофенилфосфата (1 мг/мл) в 10%-ном растворе диэтаноламина (рН 9,8), содержащем 1 мМ хлорида магния, и инкубируют до развития желтого окра шивания раствора в ячейках. Оптическу плотность раствора при длине волны

г

ю

1687

иммобилизованные на ii i,ir-i ике ((,- Фазный иммуноФерментный анализ) или разделенные электрофорезом в поли- акриламидном геле и перенесенные на лист нитроцеллюлозы (иммуноблоттинг).

Для полумения препарата МонАт в количестве, необходимом для проведения иммунохимических исследований, асцит- ную жидкость освобождают от клеток центрифугированием и добавляют сульфат натрия до конечной концентрации 18%. Осадок отделяют центрифугированием, растворяют в 0,02 М

15 (рн 8,0) и диализуют против этого же

5

0

5 0 г

бубера. После диализа раствор наносят на колонку 16x200 мм с DEAE-Toyopearl 650 И, уравновешенную тем же буфером. Антитела элюируют линейным градиентом NaH2P04 (рН 8,0 - 1 10 - 160 мМ) . Иммуноглобулины класса IgGl элюируют в интервале 60 - 30 мМ, чистота препарата по данным электрофореза в поли- акриламидном геле составляет не менее 95%.

Тестирование специфичности взаимодействия МонАТ с антигенами методом твердофазного иммуноферментного анализа.

На полихлорвиниловую 96-ячеечную панель (Flow) для микротитрования сорбируют антиген - 2 мкг на ячейку в 50 мкл ЗФР при 4° С в течение ночи. После этого в ячейках панели в течение 1 ч инкубируют по 200 мкл раствора казеина (2 мг/мл), содержащего 0,1% твин-20 в ЗФР, для уменьшения неспецифического связывания антител с пластиком. Затем в ячейки вносят по 50 мкл раствора антител 5А2 в 0,05 М трис-буфере (рН 7,4), содержащем 0,15 М МаС1 и 2- мг/мл казеина, и инкубируют 1 ч при 20°С.

После этого панель отмывают 3 раза струей воды и вносят по 50 мкл раствора конъюгата щелочной фосфатазы с антителами кролика против иммуноглобулинов мыши, разведенного в 1000 раз тем же буфером, и инкубируют в течение I ч. После 3-кратной промывки в ячейки вносят по 100 мкл раствора п-нитрофенилфосфата (1 мг/мл) в 10%-ном растворе диэтаноламина (рН 9,8), содержащем 1 мМ хлорида магния, и инкубируют до развития желтого окрашивания раствора в ячейках. Оптическую плотность раствора при длине волны

40S им опр мрплюi i немочью rti i po- спектрск ю гометрл.

В качество контрольного антигена используют Фибронектин.

Результаты показывают, что антитела эффективно связываются с Фибри- иогеном человека, практически не взаимодействуя с Фиброчектином.

Определение специфичности антител 5А2 по отношению к цепям Фибриногена.

Препарат фибриногена человека разделяют электрофорезом в полиакриламид ном геле с экспоненциальным градиентом концентрации полиакриламида от 7 до 18% в восстанавливающих условиях, и разделенные цепи Фибриногена элект- рофоретически переносят на нитроцел- люлозную мембрану. Мембрану окрашивают методом иммуноблоттинга, используя концентрацию антител 5А2, равную 5 мкг/мл. При этом наблюдают окрашивание полосы с мол. массой 70 кД, что соответствует Aftt-цепи фибриногена. Таким образом, полученное антитело взаимодействует с детерминантой, находящейся на Аб -цепи Фибриногена.

Изучение специфичности антител 5А2 по отношению к протеолитическим фрагментам Фибриногена.

К раствору Фибриногена (3 мг/мл) в 0,05 М трис-хлорида, 0,15 М хлорида натрия и 5 мМ хлорида кальция (рН 7,4) добавляют плазмин до 0,2 ед/мл и инкубируют при комнатной температуре. Через 1,2,10,30 и 60 мин расщепление останавливают добавлением апротинина до 100 калликреиновых единиц на 1 мл. Полученные препараты фибриногена различных степеней расщепление разделяют гель-электрофорезом, переносят на нитроцеллюлозу и окрашивают методом иммуноблоттинга с использованием антител 5А2. При этом наблюдают окрашивание полос с мол.массами 340,45,22, 20,17 и 15 к. Первая из них соответствует интактному, нерасщепленному фибриногену, остальные - продуктам его деградации. При этом через 30 мин остается лишь полоса с мол.массой 15 кД, а через 60 мин и она практически исчезает. В соответствии с известными данными, что наиболее чувствительным к действию плазмина является С-концевой участок Аоб-цепи, делают вывод о том, что антигенная детерминанта, узнаваемая антителом 5А2, находится именно в этом участке. Характерной особенностью детерминанты яв

МПЧГЯ Tii, ЧТО 0|1Л .. Ч гностыо расщепляется пч.ммшмм.

Пример 1. ВЧПЯННР лнгите м 5Л2 на сшивку 06-цепс н Фиорнма Ныктп- ром ХШа.

При образовании тромба в плаямо активируется специфическая трансгч г- таминаза (Фактор XIII), которая сшнвает -цепи Фибрина с образованием )Г- У-димера и fri-цепи с образованием полимеров, мол.масса которых может превышать 1000 кД. Участок сшивки 6 -цепей находится в С-концевой части

О -цепи, поэтому изучают влияние антитела 5А2 на этот процесс.

К 500 мкл донорской плазмы добавляют равный объем раствора антител 5А2 (2 мг/мл) в 0,05 М трис-хлоридном буфере (рН 7,4), содержащем 0,15 М хлорида натрия. Затем в плазму добавляют хлорид кальция до 20 мМ и тромбин до 1 ед/мл и инкубируют в течение ночи при 37°С. Образовавшийся сгусток измельчают и промывают несколько раз

буфером. После этого проводят электро- Аоретический анализ полученного препарата в восстанавливающих условиях. В качестве контролен служат образцы,

в которые вместо антител 5А2 добавляют антитела, не взаимодействующие с компонентами сгустка, или антител не добавляют.

В препарате без добавленных антител или с антителами, не взаимодействующими со сгустком, электрофореграм- ма содержит две основных полосы. Первая с мол. массой около 90 кД соответствует У- -димеру, вторая с мол.

массой 53 к соответствует/3-цепи фибрина. od -Цепь Фибрина представлена высокомолекулярными полимерами, не входящими в гель. В присутствии антител 5А2 на электроФореграмме появляются три дополнительные полосы. Полосы с мол. массами 50 и 25 кД соответствуют тяжелой и легкой цепям иммуноглобулина мыши. Полоса с мол.массой 67 кД соответствует несшитой06-цепи

Фибрина.

Полученные результаты свидетельствуют о том, что антитело 5А2, специфически взаимодействуя с Фибрином, включается в состав сгустка и при промывках не удаляется. Кроме того, это антитело ингибирует сшивку Ь&-цепей Фибрина Фактором ХШа, не влияя на сшивку у-цепей. Поскольку предполагается, что сшивкаРб-цепей происходит с

участием глутамииов 328 и 366, то можно полагать, что детерминанта для антитела 5А2 находится между этими остатками, так что антитело, связываясь с фибриногеном (фибрином), блокирует доступ фактора ХШа к обоим глутами- нам.

Пример 2. Определение изменения концентрации интактного фибриноге-|0 на в плазме человека.

В плазму человека вносят плазмин так, что его концентрация составляет 1,7 мг/мл, и инкубируют при комнатной температуре. Отбирают пробы плазмы: 15 до внесения плазмина через 5,20,60, 1800 и 3600 с. Для остановки реакции в пробы добавляют апротинин до 100 капликреиновых единиц на 1 мл. В полихлорвиниловую 96-ячеечную па- 20 нель для микротитрования, покрытую предварительно антителами 5А2 (1 мкг . в лунке) с последующим блокированием участков неспецифического связывания,

в ячейку). Через 20 мин реакцию останавливают добавлением 50%-ной серной кислоты по 50 мкл в ячейку. Оптическую плотность растворов определяют с помощью автоматического микроспектрофотометра. Параллельно в этих же пробах (но с разведением в 5000 раз) проводят определение концентрации фибриногена с помощью иммунофермент- ного диагностикума. основанного на ис пользовании поликлональных антител к фибриногену человека.

Результаты измерений оптической плотности при 492 нм показывают, что уже за 5 с инкубации с плазмином концентрация фибриногена, определяемого с помощью МонАТ 5А2, падает в 2 раза тогда как, по данным, полученным с ис пользованием диагностикума, основанного на поликлональных антителах, кон центрация фибриногена за 5 с практически не снижается. При времени инкубации более 3 мин в пробах практивносят по 50 мкл отобранных проб, раз-25 чески не остается Фибриногена, определяемого с помощью антител 5А2, тогда как поликлональный диагностикум дает снижение концентрации не более чем на 30 - 40%. Таким образом, антитела АА2 могут быть использованы для определения интактного фибриногена в плазме.

веденных в 100 раз в трис-NaCl буфере с казеином (рН 7,6), и инкубируют в течение 1 ч при комнатной температуре. После тщательной промывки ячеек пане- ли в ячейки, в которых инкубировали 30 плазму, разведенную в 100 раз, добавляют по 50 мкл конъюгата антител 5А2 с пероксидазой и инкубируют в течение 1 ч при комнатной температуре. Ячейки тщательно промывают и заполняют раст- 35 вором субстрата (в 2 мл 0,02 М цитрат- ного буфера; рН 4,7), растворяют 20 мкл раствора ортофенилендиамина в метаноле концентрации 10 мг/мл и

деляемого с помощью антител 5А2, то да как поликлональный диагностикум дает снижение концентрации не более чем на 30 - 40%. Таким образом, антитела АА2 могут быть использованы для определения интактного фибриногена в плазме.

Формула изобретени

Штамм гибридных культивируемых клеток животных Hus rausculus L. BCKK(II) № 323D - продуцент монокло нального антитела к С-концевому уча

1 мкл 30 перекиси водорода (по 100 мкл 40 СТКУ АА-цепи Фибриногена человека.

в ячейку). Через 20 мин реакцию останавливают добавлением 50%-ной серной кислоты по 50 мкл в ячейку. Оптическую плотность растворов определяют с помощью автоматического микроспектрофотометра. Параллельно в этих же пробах (но с разведением в 5000 раз) проводят определение концентрации фибриногена с помощью иммунофермент- ного диагностикума. основанного на использовании поликлональных антител к фибриногену человека.

Результаты измерений оптической плотности при 492 нм показывают, что уже за 5 с инкубации с плазмином концентрация фибриногена, определяемого с помощью МонАТ 5А2, падает в 2 раза, тогда как, по данным, полученным с использованием диагностикума, основанного на поликлональных антителах, концентрация фибриногена за 5 с практически не снижается. При времени инкубации более 3 мин в пробах практически не остается Фибриногена, определяемого с помощью антител 5А2, тогда как поликлональный диагностикум дает снижение концентрации не более чем на 30 - 40%. Таким образом, антитела АА2 могут быть использованы для определения интактного фибриногена в плазме.

Формула изобретения

Штамм гибридных культивируемых клеток животных Hus rausculus L. BCKK(II) № 323D - продуцент монокло- нального антитела к С-концевому уча