Штамм дрожжей SасснаRомYсеS ceReVISIae - продуцент интерлейкина-2 человека Советский патент 1991 года по МПК C12N15/26 

Изобретение относится к биотехноло- (ии, в частности к молекулярной генетике и генной инженерии.

Целью изобретения является повышение уровня синтеза интерлейкина-2 человека в культуральную среду.

П р и м е р 1 . Штамм Saccharomyces cerevlslae AH22-214/pVT2. несущий плаз- миду pYT2 (которая содержит ген альфа- амилазы B.amylollguifaclense, придающий клетке способность гидролизовать крахмал) и имеющий мутацию по образованию повышенных зон гидролиза на чашках с крахмалом, скрещивают со штаммом S.cerevislae ЗГ-НЗ, полученным из спорового потомства

гибридного диплоидного штамма S.cerevlsiae 52B X GRF18. В результате отбирают штамм 6B-H28/pYT2. в котором экс п ессию гена альфа-фактора можно ре улировать температурой, и который об- ладг.ет способностью к повышенной секреции альфа-амилазы. Штамм 6В-Н28 получен из штамма 6B-H28/pYT2 в результате замены плазмиды EcoR I - Hind III / фрагмент (1,25 т.п.н.) плазмиды pVC19/al, содержа щий промотор и препрообласть гена альфа- фактора, кланируют в плазмиде pBR322 по тем же сайтам с последующим переклони рованием по сайтам EcoR I Bam Ml в плаз- миду pVC19, в которой отсутствует Hind III

о

ъ

Сл OJ О

сайт В результате получают плазмиду рВА14, которую затем обрабатывают ре- стриктазой и полимеразой Кленова в присутствии дезоксирибонуклеотидтри- фосфатов, а затем рестриктазой Sal I. В обработанную таким образом плазмиду рВА14 клонируют Cfr13/Klenow Sal I фрагмент (0,55 т.н.э. плазмиды рАА1213,23, содержащий структурную область гена интерлейкина-2 человека, и в результате получают плазмиду pAI9.EcoR-Sal I - фрагмент (1,8 т.п.н) плазмиды рА19 клонируют по тем же сайтам в плазмиду pFTP4, содержащую терминатор транскрипции гена кислой фосфатазы РН05.

В полученной таким образом плазмиде сайт EcoR I затем заменяют при помощи линкеров на сайт Bam Ml, в результате получают плэзмиду pYII6B.Bam Ml - Hind III - фрагмент плазмиды pYII6B клонируют в плазмиду pJDB207 и получают плазмиду pSJI711 размером 8,9 т.п.н., содержащую ген ИЛ-2 человека под контролем препрооб- ласти гена альфа-Фактора и способная к репликации в дрожжах.

Штамм 6B-H28/pSJI711 - продуцент интерлейкина-2 человека получен трансформацией клеток S.cerevlslae 6B-H28 плазмидой pSJI711.

Характеристики штамма ВКПМ У1180.

Морфологические.

Клетки округлые, имеют размер 10-30 мкм.

Кулыуральные:

Клетки штамма хорошо растут в среде YNB с гистидином (50 мг/л) и образуют ровную интенсивную суспензию.

При росте на агаризованных средах того же состава образуют белые выпуклые колонии с ровными краями.

Физиолого-биохимические.

Клетки наращивают при 33° С, индукция гибридного гена интерлейкина-2 происходит при понижении температуры до 27° С Оптимум рН находится в интервале 4,0-5,0. В качестве источника углерода используют глюкозу, а в качестве источника азота - минеральные соли в аммонийной и нитратной форме.

Штамм является ауксотрофом по гисти- дину.

Содержание интерлейкинз-2 человека в культуральной среде данного штамма составляет 4 мг/л.

Штапмм 6B-H28/pSJI711 депонирован

во Всесоюзной коллекции промышленных микроорганизмов под номером ВКПМ У1180.

П р и м е р 2. Определение количества интерлейкина-2 человека в культуральной

среде штамма ВКПМ У1180.

Клетки штамма ВКПМ У1180 засевают в 10 мл среды YNB с гистидином (50 мкг/мл) и наращивают до плотности ОРбоо 5,0 при 33° С. Затем в среду дополнительно добэвляют 0,5 мл 40% глюкозы и клетки инкубируют еще 24 ч при 27° С с интенсивной аэрацией. Затем клетки осаждают (10 мин пои 4000 об/мин) и ИЛ-2 в супернатанте тестируют радиоиммунологическим методом при помощи стандартного набора фирмы Amersham,

Количество ИЛ-2 в культуральной среде штамма ВКПМ У1180 достигает 4 мг/л.

Биологическую активность препаратов

интерлейкина-2 текстируют по включению /ЗН/-тимидина в CTLL-клетки. CTLL-клетки представляют собой линию ИЛ-2-зависи- мых лимфоидных клеток, для поддержания которых в культуре необходимо присутствие

И.П-2 в малой концентрации (2-10 ед/мл). За 1 ед. принято такое количество интерлейкина-2, которое индуцирует 50% максимального ключения /ЗН/-тимидина в CTLL-клетки в культуре. Количество интерлейкина-2 в 1 мл культурэльной среды штамма ВКПМ У1180 составляет более 500 ед.

Таким образом, изобретение позволяет получить штамм S.cerevislae ВКПМ У1180 с выходом по ИЛ-2: 4 мкг/мл. Связывание вещества из культуральной среды штамма ВКПМ У1180 с антителами к ИЛ-2 свидетельствует о том, что этот штамм можно использовать при разработке иммунодиаг- ностикумов по определению количества

ИЛ-2 в биологических жидкостях. Наличие у вещества биологической активности дает возможность использовать данный штамм при разработке препарата для лечения ряда онкологических заболеваний.

Формула изобретения

Штамм дрожжей Saccharomyces cerevlslae ВКПМ У1180 - продуцент интерлейкина-2 человека.

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к молекулярной генетике и генной инженерии. Целью изобретения является повышение уровня синтеза интер лейкина-2 человека в культуральную среду Штамм ВКПМ У1180 получают на основе штаммов АН22-214 и ЗГ-НЗ с последующей трансформацией сконструированной плаз- мидой pSJI 711, содержащей гибридный ген интерлейкина-2 человека под контролем промотора и препрообласти гена альфа фактора дрожжей. Штамм ВКПМ V1180 можно использовать для разработки имму- нодиагностикумов по количественному тестированию интерлейкина-2 человека в биологических жидкостях, а также при разработке препарата для лечения ряда онкологических заболеваний. Уровень синтеза интерлейкина-2 в культуральную среду составляет 4 мкг/л. со С