Способ постановки цитолитических реакций Советский патент 1977 года по МПК C12K1/00 

(54) СПОСОБ ПОСТАНОВКИ ЦИТОЛИТИЧЕСКИХ РЕАКЦИЙ

Изобретение относится к области медицины и биологии и может быть использовано в лабораторной практике.

Известен способ постановки цитолитических реакций, для чего индикаторные клетки соединяют с исследуемой сывороткой (вирусом) JL.

Целью изобретения является повышение чувствительности реакции.

Это достигается тем, что индикаторные клетки подвергают обработке триэтаноламино в конечной концентрации 1:40ОО - 1:400ОО

Способ, осуществляют по двум вариантам.

Первый вариант - постановка цитолитической реакции в присутствии триэтанолами- на, второй вариант - постановка реакции с индикаторными клетками, предварительно об-, работанными триэтаноламином и отмытыми от него.

Доза триэтаноламина и время экспозиции должны быть такими, чтобы триэтаноламин сам по себе не вызвал цитолиза. Выполнение этого условия определяют первым контролем, в котором соблюдают условия опыта, но испытуемый лизирующий агент заменяют

физиологическим раствором. Вторым контролем служит взвесь клеток в физиологическом растворе для исключения спонтанного цитолиза и для определения количества использованных клеток). При отсутствии цитолиза в обоих контролях проводят учет степени цитолиза в опыте. Титром реакции принимается наибольшее разведение испытуемого вещества давшее избранную для учета степень цитолиза (25, 50, 100% разрушенных клеток).

П р и м е р 1. Первый вариант. Индикация вирусного гемолиза в присутствии триэтаноламина.

В лунках панели к 0,2 мл возрастающих разведений парагриппозного вируса 1 типа (Сендай) добавляют по О,4 мл эритроцитов морской свинки (2%-ная взвесь), 0,2 мл физиологического раствора. О,2 мл триэтаноламина (1:ЗООО на физиологическом растворе Первый контроль: вместо вируса - 0,2 мл физиологического раствора; второй контроль; вместо вируса и триэтаноламина - 0,4 мл физиологического раствора. После 2 час инкубации при 37 С в контролях гемолиз отсутствует, а в опыте 100% - ный гемолиз отмечается в титре 1:128. В параллельной реакции без триэтаноламина гемолизины обнаруживаются в титре 1:4, т.е. это вещество в конечной концентрации 1:12000 повышает чувствительность реакции гемолиза с парагриппозным вирусом 1 типа не менее, чем в 32 раза. П р и м е р 2. Второй вариант. Индикация вирусного гемолизина с использованием эритроцитов, обработанных триэтаноламином и отмытых от него. Реакцию ставят в объеме 1 мл в пробирках. К 0,2 мл возрастающих разведений парагриппозного вируса 2 типа (СА) добавляю по 0,4 мл физиологического раствора и 0,4 взвеси эритроцитов морской свинки, предварительно обработанных триэтаноламино в разведении 1:6000 на физиологическом растворе в течение 2 час при 37 С и отмытых от него. Контроль: 0,2 мл физиологи чес кого раствора вместо вируса. После 20 час инкубации при 37 С в контроле гемолиз отсутствует, в опыте 25%-ный гемолиз отмечается в титре 1:32, В параппельной реакции с нормальными эритроцитами титр гемо- лизинов 1:4, т.е. обработка эритроцитов мор ской свинки триэтаноламином в конечной кон центрации 1:6 ООО повышает чувствительнос реакции гемолиза с парагриппозным вирусом 2 типа не менее, чем в 8 раз. П р и м е р 3. Второй вариант. Титрование гемолитической сыворотки с применением эритроцитов, предварительно обработанных гризтаноламином и отмытых от него. Реакцию ставят в пробирках в объеме 2,5 мл: 0,5 мл гемолитической сыворотки в разведениях 1:40О, 1:800, 1:1600, 1:2000,1:3000,1:4000;0,5 мл 2%-нойвзвес эритроцитов барана, предварительно обработанных триэтаноламином в конечной концент рации 1:6000 с последующим отмыванием от него; 0,5 мл комплемента в разведении 1:10; 1 мл буфоркогс физиологического раст вора. Обработку эритроцитов проводят смеши закиел: равных объемов их с2% суспензии н триэтаноламина (l:30OO). Контакт - 1 ч при 37 С. Отмывание производят центрифугированием с удалением насадка. Взвесь эри роцитов доводят до первоначальной концентрации буферным раствором. Первый контроль:- физиологический раство вместо гемолитической сыворотки; второй контроль: физиологический раствор вместо к племента. После 1 час инкубации при 37 С в контролях гемолиз отсутствует, в опыте наблюдают полный гемолиз в титре 1:2000. В параллельной реакции с нормальными эритроцитами гемолитический титр равен 1:800 т.е. предварительная обработка эритроцитов гриэтаноламином с отмыванием повышает их чувствительность к гемолизинам более, чем в 2 раза. П р и м е р 4. Второй вариант. Микрометод титрования гемолитической сыворотки с применением эритроцитов, предварительно обработанных триэтаноламином и отмъттых от него. Реакцию ставят в лунках панели в объеме 0,5 мл : 0,1 мл гемолитической сыворотки в испытуемых разведениях + 0,1 мл 0,5%-ной взвеси эритроцитов барана, обработаннъ1х триэтиламином (см. пример З) + 0,1 мл комплемента 1:40 + 0,2 мл буферного физиологического раствора. Первый контроль: физиологигческий раствор вместо гемолитической сыворотки; второй контроль: физиологический раствор вместо комплемента. После 1 час инкубации при 37 С 1ОО%-ный гемолиз наблюдается в титре 1:8000, в параллельной реакции с нормальными эритроцитами титр гемолитической сыворотки равен 1:3000, т.е. обработка эритроцитов триэтаноламином с отмыванием повышает титры в 2,6 раза. П р и м е р 5. Второй вариант. Титрование комплемента в присутствии эритроцитов, обработаннъгх .триэтаноламином и отмытых от него. Реакцию ставят в пробирках по макроме- тоду в объеме 2,5 мл:0,5 мл комплемента в исследуемых разведениях; 0,5 мл 2°/о-ной взвеси обработанных бараньих эритроцитов (см. пример З), конечная концентрация три- этаноламина 1:4000; 0,5 мл гемолитической сыворотки 1:400; 1 мл буферного физиологического раствора. Первый контроль: физиологический раствор вместо комплемента; второй контроль: физиологический раствор вместо гемолитической сыворотки. После 1 час инкубации при 37 С гемолиз наблюдается в титре 1:100, в параллельной реакции с нормальными эритроцитами - 1:20, т.е. обработка эритроцитов триэтиламином в концентрации 1:4000 повышает титры реакции в 5 раз. П р и м е р 6. Второй вариант. Титрование комплемента в присутствии эритроцитов, обработанных триэтаноламином и отмытых от него. Реакцию ставят по макрометоду (см. пример 5). Время обработки эритроцитов триэтаноламином 3 час 30 мин, конечная концейтрация триэтаноламина - 1:80ОО, 1:16000, 1:20000, 1:40000. После 1 час инкубации при 37 С 100%-ный гемолиз отмечают для обработанных вышеуказанными концентрациями триэтаноламина эритроцитов в титрах 1:100, 1:100, 1:60, 1:60 соответственно. В параллельной реакции с нормальными эритроцитами титра комплемента 1:20, т.е.

ботка эритроцитов триэтаноламином в кон-следуемым материалом, отличают и нцентрации 1:80ОО и 1:16000 повышает тит-с я тем, что с целью повышения чувствитепьры реакции в 5 раз; 1:20000 и 1:40000 -ности реакции, индикаторные клетки подверг-зв 3 раза.ют обработке триэтанояамином в конечной конФормула изобретенияИсточники информации, принятые во внимаСпособ постановки цитолитических реакций1. Лабораторное дело, № 2, 1963 г с. 41

путем соединения индикаторных клеток с ис-(прототип).

551360д

5центрации 1:4000 - 1:40000.

ние при экспертизе: