Способ получения холестериноксидазы Советский патент 1991 года по МПК C12N9/04 C12N1/20 C12N9/04 C12R1/56 

Изобретение относится к области микробиологического получения ферментов, в частности фермента холестериноксидазы, который может быть применен как реагент в клинических анализах для количественного определения холестерина и в медицинской практике для снижения холестерина в крови.

Цель изобретения - повышение выхода холестериноксидазы и стабилизация холе- стериноксидазной активности.

Способ осуществляют следующим образом.

Продуцент Streptomyces lavendulae ВКПМ S-834 (ВКМ А-840Д) культивируют глубинным способом на среде, содержащей, г/л: крахмал 5,0-10,0; K2HPO j 0,5-1,5; ( SO/j 1.0-3,0; СаСОз 1,0-3,0; белкововитаминный концентрат2,0-5,0; вода до 1 л, и по достижении логарифмической фазы роста (14-16 ч) в культуральную жидкость вносят холестерин в количестве 0,002-0,005%. Выращивание продолжают до 20-24-часового возраста культуры, затем мицелий отделяют и промывают 0,5 М фосфатным буфером с рН 7,0. Из биомассы продуцента фермент экстрагируют поверхностно-активным веществом Тритон-XIOO. К 2-4%-ной суспензии клеток в 0,05 М фосфатном буфере с рН 7,0 добавляют 0.5%-ный Тритон- Х100. Экстракцию ведут при 20°С при постоянном перемешивании в течение 30 мин. Полученную смесь фильтру ют через бумажный фильтр. Фильтрат содержит холе- стериноксидазу, экстрагированную из клеток продуцента Тритоном-ХЮО.

а VJ

00 00

со

Ферментативную активность определяют по образованию холестенона в системе, содержащей 0,5 М фосфатный буфер с рН 7,0; 0,2%-ный,Твин-20; 1,5 мкМ/мл холестерина и экстракт фермента - 0,025-0,1 мл на 1,5 мл смесч. Определение ведут на спектрофотометре, измеряя изменение экстинк- ции при длине волны 240 нм, соответствующей максимальному поглощению для холестенонэ. За единицу хопесте- риноксидазной активности принимают количество мкМ холестенона, образующегося под действием холестериноксидазы за 1 мин при 37°С.

Выход фермента с 1 л культуральной жидкости составляет 2940-4500 ед, холестериноксидазы при урожае мицелия 7,0-9,0 г/л с активностью 420-550 ед./г.

При содержании в среде менее 5,0 г/л крахмала урожай мицелия значительно снижается, а внесение в среду более 10,0 г/л крахмала не оказывает влияния на процесс. Холестерин в концентрации от 0,002 до 0,005% наиболее эффективен для предотвращения снижения активности холесте- риноксидаг.ы, вызываемого физиологическими причинами в процессе культивирования Str. lavendulae ВКМ А-840 Д.

Пример 1. Культивирование продуцента Str. lavendulae ВКМ А-840 Д и подготовку посевною материала проводят на среде следующего состава, г/л: крахмал нерастворимый 10,0; К2НР04 1,0; (NN4)2804 1,0; СаСОз 3,0; белково-витаминный концентрат 3,0; рН 7,0, Посевной материал готовят в колбах Эрленмейера на 250 мл с объемом среды 70 мл, выращивание ведут на качалке с 180 об ./мин в течение 24 ч при 28°С. Количество посевного материала 10% (об./об.), Культуру выращивают в колбах Эрленмейера на 250 мл с объемом среды 70 мл на качалке с 180 об./мин. Через 14ч культивирования в колбы вносят холестерин из расчета 0.002%. Культивирование продолжают до 22-часового возраста, затем мицелий отдепяют, промывают 0,005 М фосфатным буфером с рН 7,0. Фермент экстрагируют из мицелия раствором Тритон- Х100 и определяют его содержание в экстракте. Холестериноксидазная активность составппет 550 ед./r. Урожай сухого мицелия 8 г/л. Выход фермента 4400 ед./л, Пример 2. Культивирование продуцента Str.lavendulae ВКМ А-840 Д и подготовку посевного материала проводят на среде следующего состава, г/л: крахмал нерастворимый 5,0; К2НР04 0,5; (МНф504 1,0; СаСОз 1,0; бепково-вита инный концентрат 2,0; рН 7,0, в условиях, описанных в примере 1. Через 16ч культивирования в культуральную жидкость вносят 0,003% холестерина и продолжают культивировать до 20 ч. Мицелийртделяют, промывают и определяют ферментативную активность, как описано в примере 1. Холестериноксидазная активность мицелия составляет 420 ед./г, урожай сухого мицелия 7,5 г/л; выход фермента 3150 ед./л.

Пример 3. Культивирование проду0 цента Str. lavendulae ВКМ А-840 Д проводят в условиях, описанных в примере 1, на среде следующего состава, г/л: крахмал растворимый 10,0; К2НР04 1,5; (NH4)2S04 3,0; СаСОз 3,0; белково-витаминный концентрат 5,0;

5 рН 7,0. Холестерин вносят после 16ч роста в количестве 0,004% и выращивание продолжают до 24 ч. Холестериноксидазная ак- тивйость мицелия составляет 500 ед./г, урожай сухого мицелия 9,0 г/л; выход фер0 мента 4500 ед,/л.

Пример 4. Культивирование Str. lavendulae ВКМ А-840 Д проводят в круглых колбах на 3 л с 0,5 л среды на качалке с 190 об,/мин. Посевной материал готовят в кол5 бах Эрленмейера на 250 мл с 70 мл среды, при посеве используют 14% (об./об.) 24-часовой культуры. Применяют среду следующего состава, г/л: крахмал растворимый5,0; К2Р04 1,0; (NbU)2S04 1,0: СаСОз 2,0; белко0 во-витаминный концентрат 2,0; рН 6,9. Холестерин вносят в 16-часовую культуру в количестве 0,005% и выращивание продолжают до 22 ч. Мицелий отделяют на центрифуге при 5000 об./мин, промывают и

5 определяют ферментативную активность. Холестериноксидазная активность мицелия составляет 420 ед./г; урожай сухого мицелия 7,0 г/л; выход фермента 2970 ед./л. Пример 5. Культивирование Str.

0 lavendulae ВКМ А-840 Д проводят в условиях, описанных в примере 1, используя среду следующего состава, г/л: крахмал нерастворимый 8,0; К2НР04 1.0;(NH4)zS042,0; СаСОз 2,0; белково-витаминный концентрат 4,0;

5 рЫ 6,9. Холестерин вносят в 15-часовую культуру в количестве 0,003% и выращивание продолжают до 22 ч. Холестериноксидазная активность мицелия составляет 400 ед./г; урожай сухого мицелия 8,5 г/л; выход

0 фермента 3400 ед./г.

Изобретение позволяет предотвратить быструю инактивацию фермента и повысить его выход в 2-3 раза.

Формула изобретения

5 Способ получения холестериноксидазы, предусматривающий глубинное культивирование продуцента Streptomyces lavendulae ВКПМ S-834 на питательной среде, содержащей источники углерода и азота, углекислый кальций, белково-витаминный

концентрат и воду, с последующим выделе-среду вносят двузамещенный фосфат калия нием фермента из клеток, отличающий-при следующем соотношении компонентов, с я тем, что, с целью повышения выходаг/л: крахмал 5-10; углекислый кальций 1-3; холестериноксидазы и стабилизации холе-сульфат аммония 1-3; двузамещенный фос- стериноксидазной активности, в качестве5 фат калия 0,5-1,5; белково-витаминный кон- источника углерода в питательной среде ис-центрат 2-5; вода до 1 л, при этом в пользуют крахмал, в качестве источникалогарифмической фазе роста вводят холе- азота - сульфат аммония, дополнительно встерин в количестве 0,02-0,05 г/л.

Изобретение относится к микробиологическому получению ферментов, в частности фермента холестериноксидазы,- который может быть использован в клинических анализах для количественного определения холестерина, и в медицинской практике для снижения холестерина в крови. Целью изобретения является повышение выхода холестериноксидазы и стабилизация холесте- риноксидазной активности, По изобретению продуцент Streptomyces lavendulae ВКПМ S-834 культивируют на питательной среде, где в качестве источника углерода используют растворимый или нерастворимый крахмал в количестве 5,0-10,0 г/л, в среду вводят минеральные соли, (г/л): СаСОз 1,0-3,0; ( 1,0-3,0; К2НР04 0,5-1,5; БВК 2-5, а в логарифмической фазе роста в возрасте 14-16 ч дополнительно вносят холестерин в количестве 0,02-0,05 г/л. Изобретение позволяет получать выход целевого продукта 2940-4500 ед./л при активности 420-550. ед./г. (Л С