Способ получения эритроцитарного диагностикума Советский патент 1992 года по МПК A61K47/00 

сл

с

Использование: медицина для получения эритроцитарных диагностикумов различного назначения. Цель изобретения - повышение чувствительности диагностикума. Сущность изобретения, проводят сенсибилизацию формализированных отмытых эритроцитов бройлеров на дистиллированной воде HBSAg или антителами гепатита В в присутствии коньюгирующего агента в виде хлорида хрома, затем отмывают сенсибилизированные эритроциты физиологическим раствором, добавляют защитную среду до получения 5% всвеси эритроцитов и лиофилизуют. Сенсибилизацию проводят при 54-57°С, а в качестве коньюгирующего агента используют смесь следующего состава, мас.%: 0,3%-ный р-р СиЗОз 0,25-0,35; 0,2%-ный р-р К2СГ20 0,15-0,25; 0,1%-ный р-р СгС1з 0,07-0,15; вода дистиллированная остальное. 1 табл.

Изобретение относится к области медицины и может быть использовано для получения эритроцитарных диагностикумов различного назначения.

Известен способ получения зритроци- тарного диагностикума для определения антител к австралийскому антигену в реакции пассивной гемагглютинации путем сенсибилизации отмытых эритроцитов 0/1/ группы крови австралийским антигеном в присутствии хлорида хрома с последующим отмыванием сенсибилизированных эритроцитов в физиологическом растворе, при этом эритроциты сенсибилизируют антигеном в концентрации 40-60 мкГ/мл суспензии эритроцитов в присутствии 0,07...0,13%-но- го раствора хлорида хрома и после отмывания через 3-6 ч сенсибилизированные

эритроциты обрабатывают 0,5...0,8%-ным раствором формалина при соотношении формалина и сенсибилизированных эритроцитов (0.24-0,28): 1 (см. а.с. СССР № 715088, 1980).

Достигнутый в известном способе уровень чувствительности обнаружения антител у 89.,.90% больных сывороточным гепатитом не может быть признан достаточным при обследовании доноров крови, и не удовлетворяет практическое здравоохранение.

Известен способ получения эритроци- тарного диагностикума для определения антигена гепатита В, включающий сенсибилизацию 50%-ных формализированных эритроцитов бройлеров на дистиллированной воде (8V) с иммуноглобулином

Х| XI

Ьь

00 XI

ю

со

в присутствии конъюгирующего агента в виде 0,3%-ного р-ра хлорида хрома () при температуре 37...45°С в течение 30 мин с последующим отмыванием от несвязавшегося белка и хлорида хрома физиологическим раствором, добавлением защитной среды, состоящей из бычьего альбумина, буры, сахарозы и борной кислоты на дистиллированной воде, до образования 5% концентрации взвеси и, при необходимости, лиофильной сушкой (Регламент производства иммунодиагностикума на HBs-антиген эритроцитарного иммуногло- булинового сухого № 280-82, утвержденного начальником Главного управления по производству бактерийных и вирусных препаратов Минздрава СССР от 08.04.82).

Известный способ выбран авторами за прототип.

Имея широкое применение в отечественной медицинской практике, известный способ не лишен недостатков, основными из которых являются следующие:

-уровень чувствительности недостаточно высок (10...20 НГ) по сравнению с радиоиммунным методом, разрешающая способность которого составляет 1...5 НГ;

-повышенный расход дефицитного белка в связи с необходимостью использования глобулиновой фракции с титром 1/128-1/256.

Целью изобретения является повышения чувствительности дизгностикума.

Поставленная цель достигается тем, что в известном способе получения эритроцитарного диагностикума, включающего сенсибилизацию формализованных эритроцитов в присутствии конъюгирующе- го агента с последующим их отмыванием, добавление защитной среды до конечной концентрации эритроцитов 5% и лиофили- зацию, сенсибилизацию проводят при 54- 57°С, а в качестве конъюгирующего агента используют смесь следующего состава, мас.%:

0,3%-ный р-р CuSCM - 0,25...0,35 0,2%-ный р-р К2Сг207 - 0.15..Д25 0,1%-ныйр-рСгС1з0,07...0,15

0,47....0,75 Вода дистиллированнаяостальноеТемпературный интервал, использованный в заявляемом способе, отличается более высокими значениями по сравнению с известными и активно интенсифицирует процесс сенсибилизации, при этом верхнее значение интервала (57°С) является предельным, так как его превышение вызывает распад белка, В то же время использование в качестве коньюгирующего агента смеси

CuSCM, К2Сг207, СгОз не только усиливает связывающие (дубильные) свойства агента, но и предупреждает шлакообразование, снижающее частоту диагностикума и, следовательно, чувствительность его как при определении антигена, так и антител. Оптимальность состава смеси:

0,3%-ный р-р CuSCU 0,25...0,35 0,2%-ный р-р К2Сг207 0,15...0,25

0,1%-ныйр-р ,07...0,15

Вода дистиллированнаяостальноедоказана экспериментально в процессе многочисленных исследований влияния

каждого из ингредиентов смеси в различной концентрации в индивидуальном и совместных влияниях на связующую способность суспензий эритроцитов различного происхождения и концентрации. Суммарное действие отличительных признаков предложенного способа реализует в диаг- ностикуме новый уровень чувствительности, сопоставимый с радиоиммунным методом.

Пример1.К трижды отмытым в физиологическом растворе для удаления формалина 50% эритроцитам в объеме 0,5 мл добавляют восемь объемов дистиллированной воды (,0-2,5) и осуществляют сенсибилмзацию добавлением одного объема риванольной гаммы с титром 1/16-1/32 и одного объема конъюгирующего агента в виде смеси следующего состава, мас.%: 0,3%-ный р-р CuS04 0,25

0,2%-ный р-р К2Сг207 0,25 0,1%-ный p-pCrCI30,15

Инкубацию осуществляют в термостате при 56°С. Время сенсибилизации 25 мин. После завершения сенсибилизации полученную смесь трижды отмывают физиологическим раствором от несвязавшихся белков и ингредиентов связующего агента, а затем добавляют известную защитную среду до 5% взвеси эритроцитов и подвергают лиофильной сушке.

Полученный диагностикум используют следующим образом: готовят физиологический раствор с концентрацией эритроцитов 2,5% и полученныйтестдобавляютк пробам

крови доноров в следующей последовательности:

-в лунки иммунологического планшета вносят 25 мкл исследуемой сыворотки крови донора, предварительно разведенной 1:8;

- в лунки планшета, заполненные разведенной сывороткой, добавляют 25 мкл теста (отмытых эритроцитов);

-продолжительность реакции - 25 мин. При образовании в лунках видимого

осадка в форме зонтика результат считается

положительным. Процент выявления HBsAg среди обследованных доноров составил 7-8%.

Пороговая чувствительность диагнбсти- кума, откалиброванная по параллельно по- ставленным опытам с использованием радиоиммунного метода составила 1,0-0,5 НГ антигена. Результаты апробации приведены в таблице.

Пример 2. К эритроцитам, приготов- ленным аналогично примеру 1, добавляют очищенный HBsAg в концентрации 0,1-0,2 мг/мл и сенсибилизацию осуществляют при температурном режиме и в присутствии конъюгирующего агента аналогичным при- веденнным в примере 1. Время сенсибилизации 30 мин. После завершения сенсибилизации эритроциты обрабатываются аналогично примеру 1. Использование полученного диагностикума аналогично примеру 1.

Пороговая чувствительность полученного диагностикума соответствует 0,5-0,25 ME. Частота выявления антител больных гепатитом В достигает 96 %, а у обследован- ных доноров 27. .39 %. Результаты апробации приведены в таблице.

Анализ результатов, приведенных в таблице, свидетельствует о следующем:

-чувствительность диагностикума, пол- ученного предложенным способом, как на HBsAg, так и на антитела, соизмерима с чувствительностью радиоиммунного метода и превышает известные в 10,..20 раз;

- предложенный способ отличается ста- бильностью и высокой степенью оптимизации параметров, - так снижение нижних пределов температурного интервала и РН раствора относительно оптимальных показателей указанных величин приводит к

спонтанной агглютинации, в то время как повышение верхних пределов тех же параметров относительно оптимальных показателей - к потере чувствительности, а при доведении РН раствора до 7,0 (аналогично прототипу) чувствительность диагностикума снижается до величины известного способа 10...20 ME (строка 3.2.6 таблицы);

-повышение степени выявления HBsAg и антител при массовых обследованиях доноров полученным в предложенном способе диагностикумом на 4...5 % наиболее социально необходимо и экономически целесообразно, так как предупреждает имеющие место в медицинской практике случаи сывороточного гепатита с одной стороны, и, с другой стороны, позволяет выявить заболевание на ранней стадии его;

-предложенный способ гарантирует полученному диагностикуму повышенный (в 2 раза) относительно известного срок хранения и частичную экономию дефицитного белка.

Формула изобретения Способ получения эритроцитарного диагностикума, включающий сенсибилизацию формализованных эритроцитов в присутствии конъюгирующего агента с последующим их отливанием, добавлением защитной среды до конечной концентрации эритроцитов 5% и лиофилизацией, отличающий- с я тем, что, с целью повышения чувствительности диагностикума, сенсибилизацию проводят при 54-57°С, а в качестве конью- гирующего агента используют смесь следующего состава, мас.%: 0,3%-ный раствор CuS04 - 0,25-0,35; 0,2%-ный раствор К2СГ20 -0,15-0,25; 0,1%-ный раствор CrCIs - 0,07-0,15; вода до 100.

Пример 2 (на получение диагности куна ил ан- ти-НВв антитела)

0.2

0.30,2

- состав смеси, мвс.З (остальные в составе смеси до 100% - вода дистиллированная)

.. . -. .11. .и.

Э.З 0.3

0,1 15-1 0,1 3-2 16-1

50

.-. .

2,5 57 30/35 0.1-0,2 0.3

-. .. ..

. .. .(|.. ..

.. -.. ..

..

0,25 0.35 0,2 0,1.

0,2

0,15 0.25 0.1 0.3

0,1

0,07 0.15 0,05 0.2

0,5-0,2 0,5-0,2 0.5-0,3 1,0-0,6 сп.агг.

0.2

0.30,2

.. . -. .11. .и.

Э.З 0.3

0,1 15-1 0,1 3-2 16-1

27-39 28-3530-38 15-17 Ив проверено

91-95 93-96 79-80 Не проверено

70-78 80-82 60-75

J

.и.

24

.с. -. .

,- 12

колонка 7 - концентрация НВ антигена иг/мл

колонка 11 - спонтанная аггл.остальны значения не проверяется

-J Xk

оо -g ю