Реагент для определения концентрации глюкозы в сыворотке крови Советский патент 1992 года по МПК C12Q1/28 G01N33/48 G01N33/573 

Изобретение относится к медицинской биохимии, аналитической химии, а именно к созданию наборов реактивов, позволяющих определять глюкозу в сыворотках крови ферментативным методом.

В основу наборов положен ферментативный метод, заключающийся в том, что глюкоза окисляется кислородом воздуха при каталитическом действии глюкозоокси- дазы (ГОД), с образованием перекиси водорода и / -глюконолактона. Образовавшуюся перекись водорода определяют иоиндофено- ловой реакции 4-аминоантипирина (4-ААП) с хромогеном, катализируемой пероксидазой. Количество образовавшегося красителя при

соблюдении рабочих условий пропорционально содержанию глюкозы.

Известны наборы реактивов для определения глюкозы в сыворотках крови ферментативным методом.

Известен набор реактивов для определения глюкозы ферментативным методом, включающий следующие компоненты в указанных концентрациях:

1. Смесь ферментов

Глюкозооксидаза

Пероксидаза

4-аминоантипирин

-0.22 г

-4 ед.акт./мл

-1 ед.акт./мл - 0,34 ммоль/л

V4 Os О Ю N3

Натрий сернокислый до 0,22 г

2.Хромоген (1,0 г) - 4-хлор-З-метилфе- нол 0,3 ммоль/л со Словасолом 0 и натрием сернокислым.

3.Буферный раствор - трис 0,91 моль/л рН 8.3.

4.Эталон глюкозы - 25 ммоль/л. Недостатками данного набора являются:

1.Малый срок хранения набора реактивов в растворе, который составляет 1-2 недели.

2.Применение в качестве хромогена малодоступных реактивов - 4-хлор-З-метилфе- нола и Словасола 0.

3.В практической лаборатории воспроизводимость метода с использованием данного набора невелика и составляет 8,8%.

Наиболее близким к заявленному является набор реактивов для определения глюкозы ферментативным методом, который состоит из следующих компонентов в указанных концентрациях:

1.Буфер, ферменты;, 4-ААП - фосфатный буфер 100 ммоль/л рН 7,0; ГОД 18 ед.акт./мл; пероксидаза 1,1 ед.акт./мл; 4-ААП - 0,77 ммоль/л

2.Фенол - 11 ммоль/л

3.Этанол глюкозы - 0,505; 5,55 ммоль/л.

Недостатками прототипа являются:

1.Большой расход реактивов: ГОД- 18 ед.акт./мл; фенола - 11ммоль/л; 4-ААЛ- 0,77 ммоль/л.

2.Малый срок хранения набора в растворе: 4 недели при температуре (2-8)°С.

3.Сложность приготовления набора из- за фиксированных значений концентрации компонентов набора.

Целью изобретения является улучшение воспроизводимости анализа, удешевление стоимости реагента и увеличение его стабильности при сохранении правильности определения глюкозы.

Поставленная цель достигается созданием набора, содержащего следующие компоненты в указанных концентрациях:

Ферментная смесь: при отношении активностей ГОД/пероксидаза от 18 до 4,5

1.ГОД - 4,5-9,0 ед.акт./мл

2.Пероксидаза - 0,25-2,0 ед.акт./мл

3.4-ААП - 0,19-0,056 мг/мл

4.Фенол - 0,27-1,29 мг/мл

5.Лошадиный сывороточный альбумин (ЛСА)-0,1-10,0 мг/мл

6.Буферный раствор-0,1 моль/л, калий фосфат (рН 7,0 ± 0,5) - остальное.

Определяющими отличительными признаками набора реактивов являются:

- подобранное соотношение концентраций компонентов набора;

- введение в ферментную смесь стабилизатора ЛСА, что позволило:

1.Сократить расход реактивов, за счет чего значительно удешевить стоимость на5 бора.

2.Повысить воспроизводимость анализа (с ЛСА - 3,9%, без ЛСА - 5.7%).

3.Увеличить длительность хранения раствора набора до 7 недель.

0 Предлагаемое изобретение иллюстрируется примерами.

Активность ферментов определяли по известным методикам.

Пример 1. К 1 мл раствора набора

5 реактивов (концентрация которых указана в таблице) добавили 10 мкл сыворотки Preclllp (содержание глюкозы в ней 5,67- 6,53 ммоль/л). Раствор перемешивали, выдерживали 40 мин при комнатной

0 температуре и измерили оптическую плотность исследуемого раствора и эталона глюкозы с концентрацией 10 ммоль/л на спектрофотометре при длине волны 510 нм в кварцевых кюветах с толщиной поглощаю5 щего свет слоя 1 см. Результаты анализа приведены в табл. 1.

Как видно из табл. 1, при соотношении активностей ГОД/пероксидаза от 4,5 до 18 данным набором глюкоза определяется

0 правильно (№ 1 - 3,6). При большем - 22,5 и меньшем - 3,0 отношении активностей ГОД/пероксидаза результаты анализа неправильным (№ 4 - 5).

Пример 2. Проведение анализа ана5 логично примеру 1. Концентрации компонентов и результаты анализа представлены в табл. 2.

Как видно из табл. 2, наборы правильно определяют глюкозу при концентрации ГОД

0 от4,5до9иболееед.акт./мл(№1 -3.5); при меньшей концентрации ГОД глюкоза определяется неправильно (№ 4).

При фиксированном значении ГОД и пе- роксидазы наборы правильно определяют

5 глюкозу при концентрации 4-ААП от 0,019 до 0,056 мг/мл (№3,6, 7), при концентрации 4-ААП меньше 0,019 мг/мл и больше 0,056 мг/мл глюкоза определяется неправильно (Me 8, 9).

0 ПримерЗ. Проведение анализа аналогично примеру 1, концентрации компонентов и результаты анализа представлены в табл. 3.

Как видно из табл. 3, наборы правильно

5 определяют глюкозу при концентрации фенола от 0,27 до 1,29 мг/мл (№ 1 - 3), и при концентрациях ЛСА от 0,1 до 10 мг/мл (№ 6 - 12). При меньшем содержании фенола - 0,20 мг/мл (№ 4) и большем содержании фенола - 1,42 мг/мл (№ 5) и ЛСА - 11

мг/мл (№ 13) глюкоза определяется неправильно.

ЛСД в концентрации 11 мг/мл образует в растворе набора опалесценцию и тем самым искажает результаты определения глюкозы. Хотя концентрация ЛСА 0,08 мг/мл позволяет правильно определять содержание глюкозы, она не обеспечивает хорошей воспроизводимости результатов и существенно не увеличивает срок хранения раствора набора.

Формула изобретения

Реагент для определения концентрации глюкозы в сыворотке крови, содержащий глюкозооксидазу, пероксидазу, 4-аминоан- типирин, фенол и фосфатный буферный раствор рН 6,8-7,2, отличающийся тем,

0

5

что, с целью повышения точности определения, удешевления стоимости реагента и уве- личения его стабильности, он дополнительно содержит лошадиный сывороточный альбумин при следующем соотношении компонентов: Глюкозоок- сидаза Пероксида- за

4-Аминоанти- лирин Фенол

Лошадиный сывороточный альбуминФосфатный бу4,5-9,0 ЕД 0.25-2,0 ЕД

0,019-0,056 мг 0,27-1,29 мг

5-10 мг

ферный раствор рН 6,8-7,2

1 мл

Использование: в медицинской биохимии и аналитической химии для определения глюкозы в сыворотках крови. Цель: повышение точности определения, удешевление стоимости реагента и увеличение его стабильности. Сущность изобретения: реагент для определения глюкозы представляет собой смесь следующих ингредиентов: глюкозооксидаза 4,5-9,0 ЕД, пероксидаза 0,25-2,0 ЕД, 4-аминоантипирин 0,019-0,056 мг, фенол 0,27-1.29-мг, лошадиный сывороточный альбумин 5-10 мг, фосфатный буферный раствор рН 6,2-7.2 - 1 мл. Положительный эффект: сокращается расход реактивов, повышается воспроизводимость анализа, увеличивается срок хранения реактива до 7 недель. сл с

В 1 мл 0,1 моль/л фосфатного буферного

раствора рН 7,0+0,5: ГОД ,5 ед.акт./мл

пероксидазы 0,25 ед.акт./мл;

4-ААП 0,019 мг/мл; фенол 0,2 мг/мл;

ЛСА 0,1 мг/мл.

В 1 мл 0,1 моль/л фосфатного буферного раствора рН 7,0+0,5:ГОД 9 ед.акт./мл; пероксидазы 1 ед.акт./мл; 4-ААП 0,056 мг/мл; фенол 1,29 мг/мл;

ЛСА 0,1мг/мл.

В 1 мл 0,1 моль/л фосфатного буферного

раствора рН 7,0+0,5:ГОД 8 ед.акт./мл;

пероксидазы 1,8 ед.акт./мл;

4-ААП 0,056 мг/мл; фенол 0,27 мг/мл;

ЛСА 0,1 мг/мл.

В 1 мл 0,1 моль/л фосфатного буферного

раствора рН 7,010,5:ГОД 9 ед.акт./мл;

пероксидазы 3 ед.акт./мл;

А-ААП 0,056 мг/мл; фенол 0,27 мг/мл;

ЛСА 0,1 мг/мл.

В 1 мл 0,1 моль/л фосфатного буферного

раствора рН 7,0±0,5:ГОД ,5 ед.акт/мл;

пероксидазы 0,2 ед.акт./мл;

А-ААП 0,056 мг/мл; фенол 0,27 мг/мл;

ЛСА 0,1 мг/мл.

В 1 мл 0,1 моль/л фосфатного буферного

раствора рН 7,,5: ГОД 9 ед.акт /мл;

пероксидазы 2 ед.акт./мл;

-ААП 0,056 мг/мл; фенол 0,27 мг/мл;

ЛСА 0,1 мг/мл.

6,30

5,92

6,03

5,5

5,62

6,25

N Наименование и концентрация компонентов

В 1 мл 0,1 моль/л фосфатного буферного раствора рН 7,,5:ГОД 4,5 ед.акт./мл пероксидазы 1 ед.акт./мл; 4-ДПП 0,056 м фенол 0,2 мг/мл; ЛСД 0,2 мг/мл.

В 1 мл 0,1 моль/л фосфатного буферного

раствора рН 7,,5:ГОД 9 ед.акт./мл;

пероксидазы 1,0 ед.акт./мл;

4-ААП 0,056 мг/мл; фенол 0,27 мг/мл;

ЛСД 0,2 мг/мл.

В 1 мл 0,1 моль/л фосфатного буферного

раствора рН 7,,5:ГОД 7 ед.акт./мл;

пероксидазы 1 ед.акт./мл;

4-АПП 0,056 мг/мл; фенол 0,27 мг/мл;

ЛСД 0,2 мг/мл.

В 1 мл 0,1 моль/л фосфатного буферного

раствора рН 7,OiO,5:rOfl 3 ед.акт./мл;

пероксидазы 1 ед.акт./мл;

4-ААП 0,056 мг/мл; фенол 0,27 мг/мл;

ЛСА 0,2 мг/мл.

В 1 мл 0,1 моль/л фосфатного буферного

раствора рН 7,0±0,5:ГОД 18 ед.акт./мл;

пероксидазы 1 ед.акт./мл;

4-ААП 0,056 мг/мл; фенол 0,27 мг/мл;

ЛСА 0,2 мг/мл.

В 1 мл 0,1 моль/л фосфатного буферного

раствора рН 7,OiO,5:rOfl 9 ед.акт./мл;

пероксидазы 1 ед.акт./мл;

4-АПП 0,019 мг/мл; фенол 0,27 мг/мл;

ЛСА 0,2 мг/мл.

В 1 мл 0,1 моль/л фосфатного буферного

раствора рН 7,010,5:ГОД 9 ед.акт./Нл;

пероксидазы 1 ед.акт./мл;

4-ААП 0,056 мг/мл; фенол 0,2 мг/мл; ЛСА 0,2 мг/мл.

В 1 мл 0,1 моль/л фосфатного буферного

раствора рН 7,OtO,5:rOfl 9 ед.экт./мл;

пероксидазы 1 ед.акт./мл;

4-АПП 0,016 мг/мл; фенол Q,27 мг/мл;

ЛСА 0,2 мг/мл.

В 1 мл 0,1 моль/л фосфатного буферного раствора рН 7,0±0,5:ГОД 9 ед.акт./мл; пероксидазы 1 ед.акт./мл;

4-ААП 0,062 мг/мл; фенол 0,27 мг/мл; ЛСА 0,2 мг/мл.

Таблица 2

Определено глюкозы, мноль/л

В 1 мл 0,1 моль/л фосфатного буферного

раствора рН 7,,5:ГОД Э ед.акт./мл;

пероксидазы 1 ед.акт./мл;

4-ААП 0,050 мг/мл; фенол 0,27 мг/мл;

ЛСА О,1 мг/мл.

В 1 мл 0,1 моль/л фосфатного буферного

раствора рН 7,010,5:ГОД $ ед.акт./мл;

пероксидазы 1 ед.акт./мл;

4-ААП 0,050 мг/мл; фенол 1,29 мг/мл;

ЛСА 0,1 мг/мл.

В 1 мл 0,1 моль/л фосфатного буферного

раствора рН 7,,5:ГОД 9 ед.акт./мл;

пероксидазы 1 ед.акт./мл;

4-ААП 0,050 мг/мл; фенол 0,65 мг/мл;

ЛСА 0,1 мг/мл.

В 1 мл 0,1 моль/л фосфатного буферного

раствора рН 7,0±0,5:ГОД 9 ед.акт./мл;

пероксидазы 1 ед.акт./мл;

4-ААП 0,050 мг/мл; фенол 0,20 мг/мл;

ЛСА 0,1 мг/мл.

В 1 мл 0,1 моль/л фосфатного буферного

раствора рН 7,0±0,5:ГОД 9 ед.акт./мл;

пероксидазы 1 ед.акт./мл;

4-ААП 0,050 мг/мл; фенол 1,42 мг/мл;

ЛСА 0,1 мг/мл.

В 1 мл 0,1 моль/л фосфатного буферного

раствора рН 7,0±0,5:ГОД 9 ед.акт./мл;

пероксидазы 1 ед.акт./мл;

4-АПП 0,050 мг/мл; фенол 0,65 мг/мл;

ЛСА 0,2 мг/мл.

В 1 мл 0,1 моль/л фосфатного буферного

раствора рН 7,0±0,5:ГОД 9 ед.акт./мл;

пероксидазы 1 ед.акт.мл;

4-ААП 0,050 мг/мл; фенол 0,65 мг/мл;

ЛСА 0,1 мг/мл.

В 1 мл 0,1 моль/л фосфатного буферного

раствора рН 7,0±0,5:ГОД 9 ед.акт./мл;

пероксидазы 1 ед.акт./мл;

А-ААП 0,050 мг/мл; фенол 0,65 мг/мл;

ЛСА 0,15 мг/мл.

В 1 мл 0,1 моль/л фосфатного буферного

раствора рН 7,0±0,5:ГОД 9 ед,акт./мл;

пероксидаза 1 ед.акт./мл;

-ААП 0,050 мг/мл; фенол 0,65 мг/мл;

ЛСА 0,08 мг/мл.

ТаблицаЗ

Продолжение табл. 3

LZZZZZZZZIZ

0 В 1 мл 0,1 моль/л фосфатного буферного5,99

раствора рН 7,,5:ГОД 9 ед.акт./мл; пероксидазы 1 ед.акт./мл; -ААП 0,050 мг/мл; фенол 0,65 мг/мл; ЛСА мг/мл.

1В 1 мл 0,1 моль/л фосфатного буферного5,75 раствора рН 7,0+0,5:ГОД 9 ед.акт./мл; пероксидазы 1 ед.акт./мл;

}-ААП 0,050 мг/мл; фенол 0,65 мг/мл; ЛСА 2 мг/мл.

2В 1 мл 0,1 моль/л фосфатного буферного5,70 раствора рН 7,OiO,5:rOfl 9 ед.акт./мл; пероксидазы 1 ед.акт,/мл;

-ААП 0,050 мг/мл; фенол 0,65 мг/мл; ЛСА 10 мг/мл.

3В 1 мл 0,1 моль/л фосфатного буферного6,60 раствора рН 7,,5:ГОД 9 ед.акт./мл; пероксидазы 1 ед.акт./мл;

-ААП 0,050 мг/мл; фенол 0,65 мг/мл; ЛСА 11 мг/мл.