Способ определения лектиновой активности Советский патент 1992 года по МПК G01N33/48 

Изобретение относится к области биотехнологии, в частности к исследованию биологических материалов, а именно к способам определения лектиновой активности и может найти применение при анализе биологических объектов и определения структуры и качественного состава лектинов.

Известен способ определения лектиновой активности при гемагглютинации. Принцип его заключается в том, что к серии последовательных разведений добавляют 2%-ную суспензию эритроцитов и после инкубации определяют агглютинацию эритроцитов визуально. Титр пектина выражают наибольшим разведением раствора, дающего агглютинацию.

Недостатками этого способа являются использование эритроцитов для тестирования гемагглютинирующей активности. Во-первых, не всегда имеется возможность взятия крови у животных из-за их отсутствия или болезни. Необходимы большие средства для поддержания вивария. Во-вторых, эритроциты могут храниться в хорошем состоянии очень ограниченное время (сутки или несколько суток), по истечении которого необходимо повторное взятие крови. Кроме

того, с помощью традиционного способа тестирования лектинов по агглютинации эритроцитов не могут быть выявлены лектины из всех объектов. Предложен способ определения лектиновой активности с помощью клеток микроводоросли Chlamydomonas reinhardtii CW-15, с помощью которого могут быть выявлены лектины, имеющие угле- водсвязывающие участки, характерные для растительных объектов и не взаимодействующие с эритроцитами или другими ранее предложенными объектами.

Целью изобретения является расширение сферы возможностей способа и уменьшение трудоемкости процесса.

Поставленная цель достигается новым способом определения лектиновой активности с использованием способности отдельных клеток к агглютинации и последующей визуальной оценкой ее, причем в качестве отдельных клеток используют микроводоросль Chlamydomonas reinhardtii CW-15, агглютинацию проводят методом последовательных четырехкратных разведений лектина в известной концентрации при рН 7.0-7,4 и концентрации клеток 1,5- 2,5%.

сл

с

4 Vj 00 О О 00

При проведении реакции агглютинации при рН больше или меньше названных пределов клетки водорослей лизируют. При концентрации клеток ниже 1,5% осадка не образуется, при концентрации выше 2,5% во всех лунках выпадает осадок,

П р и м е р 1. Для проведения реакции гемагглютинации берут нужный объем раствора крови в консерванте, трижды отмывают физиологическим раствором на холоде при центрифугировании 1,5тыс об/мин 10 мин и ресуспендируют в фосфатном буфере рН 7,2 до концентрации эритроцитов 2%. Эту суспензию используют для определения лектиновой активности на пластиковых планшетах c.U-образными лунками с объемом 200 мкл. Калиброванный пипеткой в каждую лунку вносят, по 150 мкл буфера, в neoavio лунку добавляют 50 мкл раствора коммерческого лектина конканавалина А(соп А; в фосфатном буфере 1 мг7мл и делают последовательное четырехкратное разведение этого лектина. Затем в каждую лунку вносят по 50 мкл суспензии эритроцитов и перемешивают содержимое лунок путем осторожного встряхивания планшета в горизонтальной плоскости. Оставляют на 2 ч при комнатной температуре, Результаты реакции учитывают невооруженным глазом. Определяют последнее разведение белка, при котором еще происходит гемагглютинация. В тех лунках, где белок вызывает агглютинацию, эритроциты покрывают дно ровным слоем. При отсутствии агглютинации они скапливаются в центре углубления лунки, образуя компактную пуговку с резко очерченными краями. Конканавалин А вызывает агглютинацию эритроцитов в первых шести зунках, следовательно активность этого препарата составляет 0,244 мкг/мл.

П р и м е р 2, Для проведения реакции альгоагглютинации берут нужный объем суспензии микроводоросли ChlamydOmonas relnhardtii CW-15, культивирование которой проводят в накопительном режиме в стерильных условиях при постоянном освещении 60 Вт/м2, температуре 26-28°С и непрерывном барботировании газовоздушной смесью, содержащей 1,7-2% СО в различного типа культуральных сосудах. Среда для культивирования содержит, г/л: МЩС 5,MgS04«7H202, CaCl2 2H20 1, К2НР04 14,4,

КНаРОз 7,2, раствор микроэлементов для сине-зеленых водорослей 1 мл. Отмывают физиологическим раствором на холоде при центрифугировании 2000 об/мин 10 мин и ресуспендируют в фосфатном буфере рН 7,2 до концентрации клеток 2%. Эту суспензию используют для опредеяения лектиновой активности на пластиковых пл&ншетах с Liобразными лунками с объемом 200 мкл. Калиброванной пипеткой в каждую лунку вносят по 150 мкл буфера, в первую лунку добавляют 50 мкл раствора con А в фосфатном буфере 1 мг/мл и делают последовательное четырехкратное разведение белка. Затем в каждую лунку вносят по 50 мкл суспензии водорослей и перемешивают содержимое лунок путем осторожного встряхивания планшета в горизонтальной плоскости. Оставляют на 1 ч при комнатной температуре. Результаты реакции учитывают невооруженным глазом. Определяют последнее разведение белка, при котором еще

произошла альгоагглютинация. В тех лунках, где белок вызывает агглютинацию, клетки водорослей покрывают дно ровным слоем. При отсутствии агглютинации они скапливаются в центре углубления лунки.

Con А вызывает агглютинацию клеток хламидомонады в первых пяти лунках, следовательно активность этого лектина составляет 0,98 мкг/мл.

ПримерЗ. Для проведения реакции

альгоагглютинации берут нужный объем суспензии микроводоросли хламидомонады, отмывают физиологическим раствором при центрифугировании 2000 об/мин 10 мин на холоде и ресуспендируют в фосфатном

буфере рН 7,0 до концентрации клеток водорослей 1,5%. Далее реакцию альгоагглютинации проводят аналогично примеру 2. Активность Con А по агглютинации клеток хламидомонады составляет 0,98 мкг/мл.

П р и м е р 4. Реакцию альгоагглютинации проводят аналогично примеру 2. После центрифугирования клетки хламидомонады ресуспендируют в фосфатном буфере рН 7,4 до концентрации 2,5%. Активность Соп А по

агглютинации клеток хламидомонады составляет 0,98 мкг/мл.

Результаты примеров 2-4 показывают, что предлагаемый способ дает возможность определить лектиновую активность при помощи клеток хламидомонады, уменьшить его трудоемкость в связи с заменой животных клеток на клетки микроводорослей.

50

Формула изобретения

Способ определения лектиновой активности, включающий приготовление серии последовательных разведений исследуемо- го образца, содержащего лектины, добавление к исследуемому образцу суспензии клеток тест-объекта, инкубацию смеси и визуальную оценку реакции агглютинации, о т- личающийся тем, что, с целью ускорения процесса, в качестве тест-объекта испольэу517786986

ют клетки микроводоросли Chlamydomonas инкубацию проводят в течение 1 ч при рН relnhardii CW 15 в концентрации 0,3 05%реакционной смеси 7,0-7,4

Использование: физиология растений, биотехнология, иммунология. Сущность изобретения: для определения лектиновой активности готовят ряд последовательных разведений исследуемого образца, добавляют к нему клетки микроводоросли Chlamydomonas reinhardli CW 15 и проводят реакцию агглютинации в течение 1 ч при рН реакционной смеси 7,0-7,4.