Способ определения сенсибилизации к эпихлоргидрину Советский патент 1992 года по МПК G01N33/60 

сл

с

Изобретение относится к медицине и может быть использовано для определения сенсибилизации к эпихлоргидрину в профилактических учреждениях. Целью изобретения является повышение точности способа. Сущность: используют коньюгат эпихлор- гидрина и человеческого сывороточного альбумина, состоящий из 14 моль М-(2-гид- рокси-3-хлора) пропиленовых групп на 1 моль альбумина человека (М.М. 67 кДа), ставят реакцию властной трансформации с меченым 3Н-тимидином с лимфоцитами периферической крови и при увеличении числа импульсов в 5-10 раз по сравнению с контролем определяют наличие сенсибилизации к эпихлоргидрину.

Изобретение относится к медицине, в частности к иммунологии и гигиене труда и профессиональной патологии, и может быть использовано для выявления сенсибилизации организма обследуемых к эпихлоргидрину в профилактических учреждениях.

Известны способы определения сенсибилизации к эпоксидным смолам и их аллергенным компонентам путем накожных аппликаций нативных смол, их растворов в органических растворителях и их аллергенных компонентов (М.П.Пушкарь. Основные вопросы гигиены труда при производстве и применении компаундов на основе эпоксидных смол. Эпихлоргидрин, его токсико- лого-гигиени1:еская характеристика и значение в гигиенической регламентации новых эпоксидных смол.

Способы, описанные в вышеуказанных работах, недостаточно специфичны и надежны, особенно при определении сенсибилизации у лиц, подвергшихся ингаляционному воздействию летучих продуктов эпоксидных смол. Кроме того, при их применении существует опасность провоцирования клинических проявлений сенсибилизации, усиления и генерализации имеющегося аллергоза.

Известен способ выявления сенсибилизации к эпихлоргидрину, предложенный О.Г.Алексеевой, ЛАДуевой (Аллергия к промышленным химическим соединениям. - М.: Медицина, 1978, 272 с.). В предложенном способе для определения сенсибилизации к эпихлоргидрину используется классический метод реакции специфического лизиса лейкоцитов (РСЛЛ) периферической крови, в котором в опытные пробирки добавляли рабочую дозу эпихлоргидрина. Учет реакции проводился морфологически путем подсчета числа лейкоцитов в камере Горяеаа в опытной пробе (с добавлением пихлоргидVIоо w

4 4

рина) и контрольной пробах с физраствором и последующего вычисления показателя РСЛЛ в процентах по соответствующей формуле. Однако данный способ недостаточно точен, поскольку для постановки ре- акции в качестве антигена используется чистый эпихлоргидрин, являющийся по существу гаптеном. Данный способ не обеспечивает достаточно надежного выявления сенсибилизации к эпихлоргидрину. Зачастую у обследуемых лиц получают отрицательный результат на фоне имеющегося у них аллергоза (степень выявления аллергии по данному способу составляет 70-81%). Это связано с тем, что эпихлоргидрин явля- ется гаптеном и приобретает свойства полноценного антигена после присоединения к молекуле белка-носителя...

Целью изобретения является повышение точности за счет использования конью- гата эпихлоргидрина с альбумином сыворотки человека, полученном алкилиро- вания эпихлоргидрином донорского сывороточного альбумина по а -аминогруппе и Ј-аминогруппам лизина (14 молей N (2-гид- рокси-3-хлор) пропиленовых групп на 1 моль альбумина (М .м. - 67 кДа).

Способ получения коньюгата осуществляется следующим образом. Для получения строго специфического коньюгата эпихлор- гидрина и альбумина сыворотки человека в реакционной смеси берется соотношение реагентов из расчета 1 моль эпихлоргидрина на 1 моль свободных аминогрупп в молекуле белка по схеме: нги-сн-со(ны-сн-со)5 +5бсн2-снн:н2-С1

сн2-мнг

C1-CH2-CH-CHzNH-CH-CO-(HN-CH-CO-)55

ОНRС.Не

снг-мн-сн2-сн-снгон

Сывороточный альбумин человека содержит одну концевую аминогруппу и 55 остатков лизина с первичными аминогруп- нами в боковых цепях. Первичные аминогруппы альбумина (56 аминогрупп на 1 макромолекулу белка) легко реагируют с эпихлоргидрином с образованием N-гидро- ксихлорпропилированных производных альбумина.

Реакция проводится при температуре 18-25°С в водной среде с последующей отгонкой воды в вакууме при температуре не превышающей +35°С и сушкой в вакууме до постоянного веса. Полученный (2-гидро- кси-3-хлор) пропилированный альбумин представляет собой светло-серое кристаллическое вещество, хорошо растворимое в

воде. Оно содержит 2,94% хлора, 14,4% азота. Средняя молекулярная масса 67 кДа. Ее определяли после проведения электрофореза в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата № по известной методике (U.K.Laemmll. Cleavage of structural protein during the assembly the head of baCJerlophage T4//Nature, 1970, - V.227, -N 559. -P.680-685. Молекулярная масса интактного сывороточного альбумина 67 кДа. Интактный и модифицированный белок после проведения электрофореза выходит одной полосой. Полученные данные свидетельствуют о том, что в процессе гид- роксипропилирования ковалентная структура белка сохраняется.

С целью повышения точности определения сенсибилизации к элихлоргидрину используют полученный вышеописанным способ коныогат эпихлоргидрина и альбумина сыворотки человека в реакции бласт- ной трансформации с меченым Н-тимидином с лимфоцитами периферической крови обследуемых и при увеличении числа импульсов в 5-10 раз по сравнению с контролем определяют сенсибилизацию к эпихлоргидрину.

Способ осуществляется следующим образом. Из 10 мл стерильной периферической крови обследуемых пациентов и доноров с гепарином путем центрифугирования в градиенте плотности фиколл-верог- рафин (оптическая плотность - 1,077) выделяется взвесь стерильных лимфоцитбв, В боксе в стерильных условиях в пробирки вносится- по 1,0 мл среды RPMI, которая готовится из расчета в 100 мл бидистиллиро- ванной воды растворяется навеска 1536 мг. Среда RPMI также содержит Hepes 4,76 г/л, 10% эмбриональной телячьей сыворотки, 50 ед/мл пенициллина и 50 ед/мл стрептомицина. В контрольные пробирки вносится по 0,1 мл взвеси лимфоцитов - 5,0x106 клеток/мл среды и 0,1 мл разведенного 1:100 специфического антигена. Коныогат эпихлоргидрина и альбумина сыворотки человека вносится только в опытные образцы. Лимфоциты культивируются в термостате при температуре 37°С в течение 24-48 часов. После этого в пробирки как в опытные, так и в контрольные вносится строго равное количество меченого Н-тимидина (0,025 мкл на 1 пробу). Через 24 часа после внесения метки содержимое каждой пробирки фильтруется с помощью вакуумного насоса через специальные миллипороеые фильтры, промывается трихлоруксусной, дистиллированной -водой и фиксируется 96° этиловым спиртом. После этого с каждого фильтра.

содержащего лимфоциты из отдельных пробирок, считывается число импульсов. Всего с помощью предложенного способа было обследовано 45 пациентов и 20 доноров. Точность выявления сенсибилизации к зпи- хлоргидрину составляет 92%.

Способ подтверждается следующими примерами:

Пример 1. Обследуемый К-к В.Д.

1934 г,р., мужчина, работает в контакте с эпихлоргидринсодержащими смолами в течение 23 лет. Общий анализ крови: СОЭ 7 мм/час, гемоглобин 134 г/л; лейкоциты 10,4- 10б/л; лимфоциты 32%; юные 1%; па- лочкоядерные 4%; сегментоядериые 48%; эозинофилы 10%; моноциты 5%;

РБТЛ: Число импульсов. Контроль - 5183. Опыт-55324.

Таким образом, число импульсов, в опытных образцах повышено в 10 раз по сравнению с контрольными, следовательно, у данного пациента выявлена сенсибилизация к эпихлоргидрину.

Пример 2. Обследуемый Р-й В.П., мужчина, 1940 г.р., работает в контакте с эпихлоргидринсодержащими смолами в течение 5 лет. Больной предъявляет жалобы на одышку, зуд кожи лица и рук. Предполагаемый диагноз - астматический бронхит, аллергический дерматит.

Общий анализ крови: СОЭ 4 мм/час, гемоглобин 140 г/л; лейкоциты 6,8x10 /л; лимфоциты 30%; юные 1%; палочкоядер- ные 3%; сегментоядерные 44%; зозинофи- лы 9%; моноциты 13%.

РБТЛ: Число импульсов. Контроль - 2525. Опыт-24359.

Таким образом, число импульсов в опытных образцах со специфическим антигеном превышает практически в 10 раз число импульсов в контрольных пробах. Следовательно, у данного обследуемого выявлена специфическая сенсибилизация к эпихлоргидрину.

Пример 3. (Контроль). Обследуемый Р-а В.Г., мужчина 1938 г.р., работает сборщиком-клепальщиком, профессионального

контакта с химическими веществами не имеет.

Общий анализ крови: СОЭ 5 мм/час,

гемоглобин 150 г/л; лейкоциты 6,0х106/л;

5 лимфоциты 25%; юные 0; палочкоядерные

0;сегментоядерные 65%; эозинофилы 2%;

моноциты 8%.

РБТЛ: Число импульсов. Контроль - 2849,5. Опыт-3071.

0 Таким образом, число импульсов в опытных образцах со специфическим антигеном (с эпихлоргидрином) практически не превышает количества импульсов в контрольных образцах. Следовательно, у данно5 го пациента не выявлена сенсибилизация к эпихлоргидрину и эпоксидным смолам.

Всего с помощью предлагаемого способа обследовано 45 больных и 20 лиц, в процессе своей трудовой деятельности не

0 контактировавших с эпоксидными смолами и эпихлоргидрином. Точность выявления сенсибилизации к эпихлоргидрину составляет 92-95%. Тогда как по способу, описанному в качестве прототипа к данной заявке

5 О.Г. Алексеевой, ЛА Дуевой. Алерргия к промышленным химическим соединениям. - М.: Медицина, 1978, -272 С., выявляемость (точность) определения сенсибилизации к эпихлоргидрину составляет не более 70-81 %.

0 Ф ормула изоб ретен ияСпособ определения сенсибилизации к эпихлоргидрину путем добавления к лейкоцитам периферической крови человека эпи- хлоргидрина с последующим учетом

5 результата,отличающийся тем,что,с целью повышения точности способа, из периферической крови выделяют лимфоциты, а эпихлоргидрим используют в конъюгате, полученном путем алкилирования эпихлор0 гидрином альбумина сыворотки человека по «-аминогруппе и е-аминогруппам лизина (14 молей М-(2-гидрокси-3-хлор)пропиленовых групп на 1 моль альбумина - М.м. 67 кДа, и учет результата ведут по реакции Властной

5 трансформации лимфоцитов меченых 3Н-ти- мидином и при увеличении числа импульсов в 5-10 раз по сравнению с контролем определяют сенсибилизацию к эпихлоргидрину.