Штамм бактерий BacILLUS SUвтILIS - антагонист возбудителей клебсиеллезов Советский патент 1992 года по МПК C12N1/20 A61K35/74 

Изобретение относится к микробиологии и может быть использовано при получении биопрепаратов, используемых для профилактики и лечения острых желудочно- кишечных заболеваний человека и сельскохозяйственных животных, вызванных бактериями рода Klebsiella.

Известно использование биопрепаратов на основе живых микробных культур, предназначенных для профилактики и лечения острых желудочно-кишечных заболеваний человека и сельскохозяйственных животных. Так, для профилактики и лечения острых желудочно-кишечных заболеваний человека используются микроорганизма Streptococcus facium штамм Gernelle

№ С1В 10415 Bacillus licheniformi s штамм № 31 и Bacillus subtilis штамм № 3, предложенные в качестве основы препарата биоспорин 2. Bacillus cereus используется в качестве активного компонента лекарственного препарата, предназначенного для лечения желудочно-кишечных заболеваний у жвачных животных 3. Однако описанные выше микроорганизмы не оказывают ингибирующего действия на бактерии рода Kbebsiella.

Наиболее близким аналогом является представитель рода Bacillus, на основе которого получен выпускаемый югославской фирмой Таленика препарат бактисубтил. предназначенный для профилактики и лечеVJ-Ч

О

о

sO hO

ния дисбактеризов 4. Однако это средство, имеет ряд недостатков: микробная культура, входящая в состав бактисубтила, характеризуется невысокой антагонистической активностью и не проявляет ингибирующе- го действия на бактерии рода Klebsiella; нет достаточных данных об основных биологических свойствах и видовой идентификации микробной культуры, входящей в состав препарата бактисубтил, что не дает полной уверенности в его потенциальной безопасности для теплокровных.

Целью изобретения является новый штамм Basillus subtilis № 945, обладающий высокой антагонистической активностью против возбудителей клебсиеллезов и характеризующийся абсолютной безвредностью для организма теплокровных.

Штамм бактерий Bacillus subtilis N2 945 получен при изучении микробиоценоза желудочно-кишечного тракта здорового теленка 10-дневного возраста. Штамм выделен из посевов содержимого толстого кишечника. Пробы высевали на средах Гаузе № 2, сусло-агар (СА) и Громыко. Дальнейшее культивирование штамма осуществлялось в лаборатории общепринятым методом - выращиванием на скошенных агаризованных средах. Штамм депонирован во Всесоюзной коллекции промышленных микроорганизмов ВНИИГенетика и имеет коллекционный номер В-5225.

Штамм Bacillus subtilis ВКПМ № В-5225 имеет следующие признаки: граммположи- тельные, аэробные спорообразующие подвижные палочки, образуют эндоспоры, не раздувающие клетки; расположение спор - центральное. Размеры клеток: (2,7-2,9)х х(0,8-0,9) мкм. При культивировании штамма на среде Громыко (мясопептонный агар (МПА) СА, 1:1) в течение 24 ч при 37°С образуются колонии плоские матовые, белые с кремовым оттенком, шероховатые, края колонии перистые. При культивировании на МПА колонии плоские, кремового цвета, блестящие, края колонии перистые, с агара легко снимаются петлей. При культивировании мясопептонный бульон (МПБ) в стационарных условиях при 37°С образуется пленка на поверхности и наблюдается незначительное помутнение среды. При выра- щении в условиях аэрации на качалках при 200 об/мин на МПБ и жидкой среде Гаузе NS 2 происходит общее помутнение среды. Штамм - аэроб, хемоорганотроф, продуцирует каталазу, не растет в анаэробных условиях, после роста на глюкозном агаре протоплазма не содержит включения по- ли-/ -оксимасляной кислоты. Редуцирует

нитраты, не образует газ в анаэробных условиях на среде с нитратами, не продуцирует сероводород и индол. Разжижает желатину, не разлагает мочевину, гидролизует крахмал. Штамм растет при температуре от 10 до 45°С. Температурный оптимум - 37°С. Растет при наличии в среде 5% хлористого натрия и не растет при 10% содержании NaCI в среде. Утилизирует глюкозу,

0 ксилозу, арабинозу, маннит и пропионат. Реакция Фогес-Проскауэра положительна. Штамм не обладает лецитиназной активностью, не нуждается в витаминах и аминокислотах - дополнительных факторах роста,

5 непатогенен для теплокровных. Маркерный признак: высокочувствителен к левомицети- ну, канамицину, эритромицину; устойчив к ампициллину, полимиксину. Культура пересевается на среде Громыко. Среда стерили0 зуется при 2 атм в течение 30 мин рН 7, температура хранения 20-22°С, срок хранения 3 мес. Хранение культуры осуществляют под минеральным маслом на среде Громыко, рН 7, температура хранения 205 22°С,срок хранения 1 год. Хранение культуры в сублимационно-высушенном состоянии: среда для выращивания - среда Громыко, рН 7, срок выращивания на протяжении 4 сут. Состав суспензионных

0 сред: NaCI 0,85 г; желатина 1 г, сахароза 4 г, дистиллированная вода до 100 мл. Режим высушивания от -20 до +30°С. Температура хранения 20-22°С. Срок хранения 5 лет. Пример 1. Антагонистические свой5 ства штамма Bacillus subtilis.

Способность штамма Bacillus subtilis ВКПМ NsB-5225 ингибировать рост бактерий рода Klebsiella проверяют методом отсроченного антагонизма. Штамм культи0 вируют на питательной среде Гаузе № 2 в течение 48 ч. Для сравнения апробируют другие штаммы Bacillus subtllis из числа активных антагонистов. Затем культуры клеббсиелл подсевают методом штриха. Ре5 зультаты исследований (величина зоны торможения, выраженная в мм) представлены в табл. 1. Все полученные данные носят статистически достоверный характер (при а- 0,95). Как видно из представленных в

0 табл. 1 данных, антагонистическое действие исследуемых штаммов было проверено по отношению к 366 культурам Klebsiella pneumonlae. Klebsiella ozaenae, Klebsiella rhinosclermatis (клинические и музейные

5 штаммы). Установлено, что более активными из бацилл оказались штаммы № 945 ВКПМ МгВ-5225, № 1108, № 1119, Однако штамм Bacillus sibtilis 945 ВКПМ N B-5225 в наибольшем числе случаев проявлял высокий уровень антагонистической активности.

Из числа исследованных 88 культур клебси- елл пневмонии, риносклеромы и озены оказались особенно высоко чувствительными к Bacillus subtilis ВКПМ N B-5225 (зона задержки роста достигала 30,2-32,3 мм), в то время, как аналогичный показатель ингиби- рующего эффекта у штаммов 1108 и 1119 Basillus subtilis наблюдался соответственно для 68 и 61 культуры. Таким образом, наиболее активным антагонистом клебси- елл оказался штамм Bacillus subtilis 945 ВКПМ №В-5225.

Штамм SP-5832 (прототип) вовсе не обладает противоклебсиеллезным действием.

Выраженное подавление клебсиелл, осуществляемое живой культурой Basillus subtilis ВКПМ №В-5225, отмечают и при совместном культивировании этих видов микроорганизмов в жидкой питательной среде Гаузе №2. Отмечено, в частности, что подавление роста клебсиелл регистрируется уже на 2-е сутки опыта. Максимальный ингиби- рующий эффект получен при дозе штамма 50 млн. микробных тел/1 мл. Кроме того, следует подчеркнуть, что торможение отмечается и в тех случаях, когда вносимое количество КОЕ тест-культур значительно превышает содержание штамма. Таким образом опыты, проведенные in vitro, свидетельствуют о том, что антагонистическое действие штамма Bacillus subtilis ВКПМ МгВ-5225 по отношению к различным штаммам клебсиелл намного превышает антагонистическую активность всех других испытанных штаммов бацилл, в том числе коллекционых и штамма IP-5832 (прототип).

Важным преимуществом штамма Bacillus subtilis ВКПМ N B-5225 перед штаммом-прототипом является его абсолютная безвредность. Проведено сравнительное исследование патогенности штамма Bacillus subtilis ВКПМ и штамма- прототипа Bacillus sibtilis IP-5832 (табл. 2,3,4). Проводят исследование:

1.Суспензии штамма Bacillus sublilis 945, выращенного на мясопептонном агаре при 37°С в течение 24 ч.

2.Фильтрата культуральной жидкости штамма Bacillus subtilis 945, выращенного в течение 10 сут на мясопептонном бульоне при37°С.

Проверку патогенности осуществляют на белых мышах весом18-20 г. Животным вводят суспензии и фильтраты в желудок через зонд и в инъекциях.

Все мыши, получавшие культуру и фильтрат штамма Bacillus subtilis ВКПМ М В-5225, оставались здоровыми на протяжении срока наблюдения.

В этот период они были активны, хорошо поедали пищевые рационы, физиологические отправления у них не нарушались, поведенческие реакции были обычными, из- 5 менений со стороны шерстного покрова не отмечалось. Динамика изменения массы тела животных в опыте и контроле было сходной. Все подопытные животные после окончания срока наблюдения были умерщв0 лены, вскрыты и их органы подвергнуты макроскопическому изучению. Результаты вскрытия. Сердце обычной формы и величины, у подопытных животных такое же, как и у кон5 трольных.

Легкие по объему, строению долей у подопытных и контрольных животных одинаковые, поверхности легких гладкие, доли легко отделяются друг от друга, спаек не

0 отмечено.

Желудок петли тонкого и толстого кишечника - внешне обычные, признаков воспалительных изменений не отмечено. При вскрытии просвета виден неизменный (та5 кой же, как и у контрольных животных) рисунок слизистых.

Печень - темно-красного цвета, среднего кровенаполнения, не увеличена. Доли отделены друг от друга, поверхности

0 гладкие.

Почки по размерам и форме не отличаются у контрольных и опытных животных, поверхности гладкие, на разрезе виден четкий рисунок коркового v. мозгового вещест5 ва.

Селезенка не увеличена, обычной консистенции. На разрезе пульпа умеренно полнокровна, темно-красного цвета.

Таким образом, введение суспензии

0 живых клеток 24-часовой культуры Bacillus subtilis ВКПМ №В-5225 внутрибрюшинно и перорально в дозах 1-5 млрд, микробных клеток на мышь не вызывало у животных каких-либо признаков заболевания. Изуче5 ние внутренних органов животных не выявило у них патологических изменений, регистрируемых макроскопически.

Введение мышам фильтратом культуральной жидкости штамма не выявило у жи0 вотных патологического процесса, регистрируемого клинически или при макроскопическом изучении внутренних органов животных.

Пример 2. Антиклебсиеллезное

5 действие штамма Bacillus sibtilis ВКПМ NeB-5225 проверяют в опытах на лабораторных животных. С этой целью осуществляют проверку профилактического действия культуры Bacillus subtilis ВКПМ NsB-5225 на течение и исход экспериментальной инфекции, вызываемой высоко вирулентной культурой Klebsiella pneumoniae штамм 3785. ЛД50 названного штамма составляет 50 млн. КОЕ. Результаты изучения профилактического действия исследуемых культур бацилл при исследовании инфекционного клебсиеллезного процесса представлены в табл. 5.

Как следует из табл. 5, особенно выраженный противоклебсиеллезный профилактический эффект наблюдают при парентеральном введении штамма Bacillus subtilis ВКПМ NsB-5225 по сравнению с штаммом 1119. Несмотря на жесткие условия опыта (летательная доза инфекта составляет 60-100), сохранность животных составляет 80, 90 и 100%. Причем отмечается определенная коррелятивная зависимость между используемой суспензии микроба-антагониста штамм Bacillus

subtilis ВКПМ №В-5225 и эффектом профилактического действия по отношению к клебсиеллезной инфекцией. Так, при парентеральном введении одного млрд. клеток

антагонпста процент сохранности составляет 90. Увеличение дозы Bacillus subtilis ВКПМ №В-5224 до пяти млрд. обеспечивает 100% сохранность взятых в опыт животных, несмотря на то, что доза инфектора превышает 100%.

Таким образом, опыты на животных подтверждают высокую противоклебсиел- лезную эффективность штамма Bacillus subtilis ВКПМ №В-5225, установленную в

опытах in vitro и его полную безвредность для теплокровных.

Формула изобретения Штамм бактерий Bacillus subtilis ВКПМ №В-5225 - антагонист возбудителей клебсиеллезов.ТаблиЧа .

Изобретение относится к микробиологии, а именно к созданию биопрепаратов, используемых для профилактики и лечения острых желудочно-кишечных заболеваний человека и сельскохозяйственных животных, вызванных бактериями рода Klebsiella. Целью изобретения является новый штамм Bacillus subtilic 945, обладающий высокой антагонистической активностью против возбудителей клебси- еллезов и характеризующийся абсолютной безвредностью для организма теплокровных. Штамм совершенно безвреден для теплокровных, является представителем нормального микробиоценоза человека и животных, оказывает ингибирующий эффект как в условиях отсроченного антагонизма, так и при совместном культивировании. 5 табл. С

20,8 ±1,2 24,9 1.3 30,1 2,1 lUiUi

вкпм

«8-5225

(945)

953

15,01 I,1 23,0 2,2 26,7t 1,9 16,4 0,3 17.8 1,6 23,711,6 23.8t 3.2 70,lit 2,Ъ

19,9t 2,6 гг,г± з,з 27,7 t.6 i3,st M

50 18,9±1,2 2li,5+2,3 32,2±2,4 17,,4

21,Oil,; 26,6t2,6 13,l 2, 21.21 2.3 28.8 t 1.2 3,5iO,3 24,8 ±4,0 29,8111,0 M,S± 1,3

1P-5832 0

Примечание. В числителе - зоне чалсо.ки роста бактерий рола клебсиеопа км исследованных клебсиеля.

Результаты исследования вирулентности культуры Bacillus subtilis ВПКМ № В-5225, выращенной в течение 24 ч на мясопептонном агаре при 37°С

; в знаменателе - абсолютное число штаммов

Таблица 2

9177969210

Таблица 3 Результаты исследования вирулентности культуры Bacillus subtilis IP-5832

Таблица 4

Результаты исследования токсигенности фильтрата культуры Bacillus subtilis ВПКМ N В- 5225 после роста на мясопептонном бульоне в течение 10 сут при 37°С

Таблица 5

Эффективность перентерального и перорального введения штаммов В. subtilis 1119 и ВПКМ N; В-5225 с целью профилактики экспериментальной клебсиеллезной инфекции у

Продолжение табл. 5