Способ получения д-рибозы Советский патент 1979 года по МПК C12D13/10 

(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ D-РИБОЗЫ

I

Изобретение относится к микробиологической промьицленности и касается техники получения D-рибозы. Наиболее близким к описктаемому изобретению является известный способ получения D-рибозы, предусматривапщий культивирование микроорганизмов рода BaciEJEus на питательной среде с последующим вьаделением D-рибозы 1.

Используемые в известно способе микроорганизмы из рода обладают довольно низкой 2-дезокси-D-гликозной окислительной активностью, составляющей 0,01-0,02 микромоля/мин/мг белка и высокой способностью к спорообразованию.

Указанный известный способ не обепечивает достаточно высокого выхода D-рибозы.

Целью изое етения является повышение целевого продукта.

Это достигается тем, что в предлагаемся способе получения О-рибозы из рода BacifZus используют микроорганизмы, обладающие по крайней мере одним из двух свойств: частотр спорообразования, равной или 2-дезокси-0-глюкозооксидирующей активностью, составляющей 0,05-1,00

микрс лоля/мин/мг белка и транскетолазной активностью не более 0,01 мик ромоля/мин/мг белка или D-рибулоэофосфат-3-эпимеразной активностью,

составляющей не более, 0,1)1 микромоля/мин/мг белка, например штаммы Baciteus pumilus 911 ( 1FO 12566), 1027 ( 1.FO 13585) и W 1083 ( t FO 13620), а также BaciSPus subtiPis

I 957 (IFO 13565), 941 (IFO 13573), 1054 ( JFO 13586), 1067 (JFG 13588) и 1097 (IFO 13621) и т.д.

В питательной среде в качестве

источников углерода используют D-глюкозу, D-фруктозу, D-маннозу, сорбит, D-маннит, сахарозу, мелассу, продукты гидролиза крахмала, крахмал, уксусную кислоту и этанол.

в качестве источников азота используют органические вещества, например жидкость для замачивания зерна (кукурузы), хлопковые отходы, дрожжевой зкстракт, сухие дрожжи,

рыбью муку, мясной экстракт, пептон, казаминокислоту и такие неорганические вещества, как, например,водный раствор аммиака, газообразный аммиак, сульфат аммония, нитрат

аммония, хлористый аммоний, карбонат

аммония,фосфат аммоиия, нитрат натрия и т.д., а также такие органические азотсодержаище вещества, как мочевина, аминокислоты н т,д

Кроме того, в питательную среду вводят также различные металлы, вн ;гг1мины, аминокислоты и другие росто ые вещества для микроорганизмов (в произвольном соотношении).

Культивирование микроорганиэмоа осуществляют в аэробных условияк, преимущественно путем встряхивания культуры или погружения культуры при разбрызгивании и перемешивавми,

Температуру инкубации выбирают в интервале 20-45 С,в зависимости от требуемой т шературы для роста индивидуального организма и на- копления D-ркбозы, рИ среды 5-9 Для : поддержания рЯ среды s нее добавляют хлористоводородную или серную кислотуд водный раствс сшмиака, газообразный аммиак, вод-ный раствор гидроокиси , карбонат кальция, гашеную известь,

Процесс накопления D-рибозы в среде проводят в течение 2-5 дней с последующим выделением О-рибодЁО, 1Сультург1льную среду фильтруют или центрифугируют, фильтрат обессоливают и обесцвечивают обработкой активиро8анньа « углем и ионообменной смолой, а затеи концентрируют.

К концентрату добавляют органиЧЕеский растворитель 6, напрши1ер таиол, и отделяют кристаллы О-ривоаы.

Пример 1. Обладакг {ий де фшштом транскетояазьа, аспорогенный мутант № 911 разновгедности Bacillus puxsiius (1РОД3566), полученный из вида BacilEus pujniSus JK 12113 в результате облучения улыграфиолетовьми лучами (транскетолазная активность не более 0,01 микро- моля/мин/мг протеина и частота, спорообразования 2x10®),используют для инокуляции 10 л среды,содержаще 0% сорбита, 2,0% жидкости для вымачивания зерна, 0,3% двузамещенного фосфорнокислого калия, 0,1% первичного кислого фосфорнокислого калияр 100 мг/л тирозина и 100 мг/л фанилгшанина.

Затем инокулировакную среду йнку .бируют при 36 с 24 ч и gee полученно количество культуры перэносят в 100 мл питательной среды следуянцего состава,%s D-глюкоэа 15,0 сухие дрожжи 1,0; сульфат аммония Q,5s карбонат кальция 2,0; триптофан 50 мг/л; пирозин 50 мг/л| фвнилала НИН 50 мг/л.

. На этой среде культивируют при 60 ч. D-рибоза накапливается со скоростью 64 мг/мл. Из жидкост фер1 внтации-D-рибозы клетки удаляют фильтрацией, фильтрат концентрируют до 0,5 первоначального

объемар добавляют примерно одну четвертую часть этанола и осадок выбрасывсцот,

Оставшийся раствор обессоливают на катионо-и анионообменных смолах, а затем обесцвечивают на колонке с активированным углем.

Обесцвеченный раствор концентрируют, разбавляют четырьмя объемами этанола, получая 5 кг кристаллической D-рибозы,

Пример2, Обладакхций дефицитсж транскетолазы аспорогенный мутант 957 вида BaciEfus subtiBus (JFO 13586), полученный кз вида subtiJis IFO;, 3026 в резуль S тате обработки N-мeтил-N-ннтpoнитрозогуанйдияом {NTG, транскетолазная активность не более 0,01 микромоля/мин/мг протеина и частота спорообразования 8x10) культиви8 PVTOT так, как описано в примере 1,

D-рибоза аккумулируется в культуральной жидкости со скоростью 62 мг/мл, при этом получают 4,6 кг кристаллической О-рибозы, как это

5 описано в примере 1.

Примерз, Обладающие дефицитом эпимеразы аспорогенный мутант i«941 вида Baciffus subtilis (.IFO 13573), полученный из вида д BacilEus subti.Sis IFO 3026 после облучения ультрафиолетовыми лучами (пммеразная активность не более 0,1 микромоля/мин/мг протеина, частота спорообразоаания 7x10), культивируют аналогично примеру 1.

5 D-рибоза накапливается со скоростью примерно 65 мг/мл, при этсял получают 4,3 кг кристаллической П-рибоэы, как это описано в примере 1. Пример4, Мутант 1027

0 разновидности BacitEus pumiPus

(IFO 13585), имеющий дефицит трансцетолазы и обладающий высокой 2-дезoкcи-D-глюкoзooкиcпитeльнoй активностью (транскетолазная активность

5 не более 0,01 микрс 5Оля/мин/мг

протеина, 2-дезокси-О-глюкозоокислительная активность 0,28 микромоля/мии/.мг протеина),который получен из вида BaciE us pumiius (РО12092

0 при облучении ультрафиолетовыми луча.миг культивируют, как описано в примере 1. D-рибоза накапливается со скоростью, примерно 63,2 мг/мл, при этом получаю.т 4,8 кг кристаллиg ческой D-рибозы так, как описано в примере 1.

Пример 5. Мутант 1-054 siibtifis (iFO 13586), обладающий дефицитом эпимеразы и имеющий высокую 2-дезокси-0-глюкозоокислительную активность (эпимеразная активность не более 0,01 микромопя/мин/мг протеина, 2-дезокси-0-глюкозоокислительная активность 0,31 микромоля/мнн/мг протеина),

Э который получен на вида Baciffus BubtiCis IFO 3026 обработкой N-метил -н-нитро-Ы-нитроэсгуанидином, культивируют, как описано в примере 1. D-рибоэа накапливается со скоростью примерно 65,7 М1/мл, при этом получают 5,1 кг кристаллов D-рибозы, как описано в примере 1. Пример 6. Мутант № 1067 вида BaciB as subtieislFO 13588, обладающий дефицитом транскетолазы,имеющий высокую 2-деэокси-В-глкисозоокислителЬную активность (транскето лазная активность - не более 0,01 ми ромоля/мин/мг протеина, 2-дезокси-D-глюкозоокйслительная активность 0,33 микромоля/мин/мг протеина), который получен из вида BaciECus subtiBis IFO. 3026 обработкой N-метклтМ-нитро-Ы-нитрозогуанидином, культивируют так, как описано в примере 1. D-рибоза накапливается со скоростью примерно 66,5 мг/м при этсм получают 5,3 кг кристаллов D-рибозы, как зто описано в примере П р и м е р 7. Обладающий дефици там транскетолазы и имеющий высокую 2-дезокси-О-глюкозоокислительную активность аспорогенный мутант № 1083 вида BaciEtus pumiEus S-1 IFO. 13620 (транскетолазная активность не более 0,01 микромоля/мин/м протеина, частота спорообразования 4x10 , 2-дезокси-0-глюкозоокиалительная активность 0,34 микромоля/мин/мг протеина,который получе из вида pumlEus облучением ультрафиолетовыми лучами, культивируют, как описано в примере 1, Скоро 5ть накапливания D-рибоэы 72,3 мг/мл, при этом получают 5,6 к кристаллической D-рибозы,как описано в примере 1. П р и м е р В. Обладающий дефици том транскетолазы аспорогенный и . имеющий высокую 2-дезокси-D-глюкозо окислительную активность мутант 1097 BaciEfus subtilis }FO 13621 (транскетолазная активность не боле 0,01 микромоля/мин/мг протмна, частота спорообразования 3x10 , , 2-де окси-О-глюкозоокислительная активность - 0,29 микромоля/мин/мг протеина), полученный из вида Bacietvis subtiEis IFO 3026 облучением ультрафиолетовыми лучами, культивируют, как описано в примере 1. D-рибоза накапливается со скоростью примерно 70,6 мг/мл, при этом получают 5,4 кг кристаллической D-рибозы, как описано в примере 1. Предлагаемый способ обеспечивает по сравнению с известным способом повьвленный выход целевого продукта за счет способности используемых микроорганизмов накапливать D-рибозу со скоростью 65-70 мг/л, тогда как в известном способе скорость накопления D-рибозы равна в лучшем случае 35,3 мг/мл, Преимуществом предлагаемого способа является также пониженная способностью микроорганизмов к спорообразованию, благодаря чему не требуется специальной методики удаления спор. Формула изобретения Способ получения D-рибозы, прелусматривающий-культивирование микроорганизмов рода BaciEEus на питательной среде с последующим наделением D-рибозы, отличающий с я тем, что, с целью повьвоення выхода целевого продукта, из рода BaciEgus используют микроорганизмы, обладающие по крайней мере одним из двух свойств: частотой спорообразования,равной 2-10® -10,или 2-яезoкcи-D-глюкoзooкcилиpyкIцeй активностью, составляющей 0,05-1,00 микромоля/мин/мг белка,и транскетолазной активностью не более,чем 0,01 микромоля/мин/мг белка или D-рибулозофосфат 3-эпимеразной активностью, составлякнцей не более,чем 0,01 микромоля/мин/мг белка, Источники информации, принятые во внимание при экспертизе 1. Патент Великобритании 1255254, кл. С 2 С, опублик. 1971.