Штамм гибридных культивируемых клеток MUS мUSсULUS L - продуцент моноклональных антител к поверхностному антигену типичных штаммов возбудителя сапа РSеUDомоNаS маLLеI Советский патент 1993 года по МПК C12N5/00 

со С

Использование: биотехнология, иммунология. Сущность изобретения: штамм получен путем слияния клеток селезенки мышей BALB/c, иммунизированных суспензией убитых бактериальных клеток возбудителя сапа, с клетками мышиной миеломы РЗ-ХбЗ-Ад 8.653. Штамм депонирован под номером ВСКК(Н) 275Д и имеет авторское наименование ММ-Рт1. Титр антител в культуральной жидкости достигает 1280, в асцитной 107. Моноклональные антитела относятся к иммуноглобулинам класса G. 2 табл.

Изобретение относится к гибридомной технологии и касается получения монокло- нальных антител (МкАт) против антигена сапа, применяемых для определения типичных штаммов Ps.mallei в реакциях им- мунофлюоресценции и непрямой гемагглю- тинации.

Для дифференцирования возбудителей, относящихся к роду Pseudomonas, используют набор тестов, основанный на сравнении биохимических и культуральных свойств микроорганизмов. Наряду с этим длительным и трудоемким методом применяют также более быстрые серологические методы дифференциации псевдомонад при помощи поликлональных антисывороток.

Однако при применении таких антисывороток практически не удается дифференцировать между собой возбудителей сапа и мелиоидоза, что свидетельствует об их чрезвычайно высоком антигенном сходстве.

Актуальным представляется использование возможностей гибридомной технологии для получения МкАт, обладающих видовой специфичностью к данным возбудителям.

Цель изобретения - штамм гибридных культивируемых клеток Mus musculus L., продуцирующий моноклональные антитела к возбудителю сапа.

Штамм гибридных культивируемых клеток Mus musculus L. - продуцент монокло- нальных антител к антигену возбудителя сапа получен путем слияния клеток селезенки мышей BALB/c, предварительно иммунизированных суспензией убитых бактериальных клеток возбудителя сапа, с клетками мышиной миеломы РЗ-ХбЗ-Ад 8.653 с помощью полиэтиленгликоля (ПЭГа), селекции на гипоксантин-аминоптерин-ти- мидиновой среде (ГАТ) и последующего кло- нирования полученных гибридом методом предельных разведении.

vj Ю

Ј

ел

Штамм депонирован в специализированной коллекции перевиваемых соматических клеток позвоночных Института цитологии АН СССР 05.07.88 под номером ВСКК(П)275Д и имеет авторское наименование ММ-Рт 1.

Полученный штамм Mus musculus L, ВСКК(П)275Д имеет следующие характеристики.

Условия культивирования штамма: температура 37°С, атмосфера с 5% С02 и 98% влажностью, среда RPMI-1640, содержащая .10% сыворотки плода .коровы, 10 мМ ГЭ- ПЭС (М-2-гидроксиэтилпиперазин-2-этан- сульфоновая кислота), 2мМ L-глутамина, без антибиотиков или с добавлением пенициллина « стрептомицина 100 ЕД/мл.

Характер роста - стационарная суспен- зия, Культура представляет собой взвесь одиночных клеток или легко разъединяющихся при встряхивании рыхлых агрегатов по 6-14 и более клеток. Оптимальная посевная доза - 1,5-2 х 105 клеток в 1 мл среды. Для поддержания культуры в пролифериру- ющем состоянии клётки р асседают два раза в неделю через 2-4 дня с кратностью рассева 1:4 - 1:10. Максимальная плотность насыщения с сохранением жизнеспособности - 8х105 - 106 клеток в 1 мл. Клетки в культуре в ыглядят округлыми, прозрачными.

Для получения асцитной жидкости мышей линии BALB/c сенсибилизируют путем внутрибрюшинного введения 0,5 мл приста- на или вазелинового масла и через 7-14 дней после этого им вводят гибридные клетки в дозе 3-5 х 106 клеток на мышь.

В реакциях иммунофлюоресценции, непрямой гемаггл ютинации и иммунофермен- тном анализе (ИФА) продуцируемые гибридомами антитела взаимодействуют с возбудителем сапа с абсолютной специфичностью.

Моноклональные антитела относятся к классу иммуноглобулинов (Ig) G. Титр имму- ноглобулинов и ИФА в культуральной жидкости - до 1280, в асцитной жидкости - до 10 ; титр МкАт в асцитной жидкости в непрямом иммунофлюоресцентном .анализе .(НИФлА)-до 1-04. Стабильностьантителоп- родукции сохраняется на протяжении 100- 120 пассажей в культуре и 10-15 пассажей на животных (срок наблюдения).

Проверка штамма на присутствие кон- таминирующих микроорганизмов, проведенная на культурах постоянно выращиваемых на среде без антибиотиков, показала отсутствие бактерий и грибов.

Штамм хранят в замороженном состоянии при температуре - 196°С, Среда крио- консервирования содержит: среды

RPMH640 - 73%, сыворотки плода коровы - 20%, диметилсульфоксмда (ДМСО) - 7%. Ампулы, содержащие 0,5 мл суспензии клеток (6x10 /мл) после выдерживания втечение 30 минут при температуре 4°С и двух часов при температуре -40°С погружают и хранят в жидком азоте. Жизнеспособность клеток проверяют после размораживания с помощью суправитального красителя 0 0,2% раствора трипанового синего. Она составляет 80-98%.

Л р и м е р 1. Использование штамма Mus musculus L ВСКК(П)275Д для получения моноклональных антител.

5 Моноклональные антитела к возбудителю сапа получают из культуральной жидкости (среды), в которой клетки штамма .выращивают вне организма и из асцитной жидкости мышей, которым клетки штамма

0 вводят внутрибрюшинно. :

Для получения антител из культураль- ной жидкости клетки штамма выращивают в стандартных условиях: при температуре 37°С, влажности 98%, СОа - 5%, в среде

5 культивирования. Затем производят постепенный рассев культуры. Клетки выдерживают для пролиферации без смены среды до достижения максимальной плотности при которой клетки погибают. Культуральную жидкость осветляют центрифугированием и

0 используют как источник антител.

Титр моноклональных антител определяют с помощью твердофазного ИФА по общепринятой схеме. Для этого образцы культуральной жидкости титруют двукрат5 ным шагом с 1:10 до 1:5120 в лунках планшетов,сенсибилизированных . водно-солевым экстрактом возбудителя сапа, В качестве отрицательного контроля используют надосадочную жидкость

0 несекретирующей антитела миеломной клеточной линии РЗ-ХбЗ-Ад 8.653, в качестве положительного - сыворотку мышей, иммунизированных убитыми бактериальными клетками возбудителя/Результаты реакции

5 учитывают визуально или с помощью вертикального спектрофотометра.

За титр антител принимают величину обратную наибольшему разведению исследуемого образца антител, давшему положи0 тельную реакцию. Титр моноклональных антител к антигену возбудителя сапа в культуральной жидкости гибридного штамма равен 640-1280.

Для получения асцитной жидкости, со5 держащей МкАт, мышам линии BALB/c вводят внутрибрюшинно 0,5 мл пристана или вазелинового масла, а спустя 7-14 дней также внутрибрюшинно вводят 3-5 млн. гибридных клеток штамма, выращенных ин

витро. Асцит развивается в течение 7-28 дней. Клетки опухоли отделяют путем центрифугирования .асцита и перевивают новой группе мышей, а жидкость используют как источник антител. .Объем асцитной жидкости, полученный от одной мыши, составляет 1-4 мл.

Определение титра антител в асцитной жидкости проводят также, как и в культу- ральной. Асцитную жидкость разводят 10- кратным шагом начиная с 1:10, делая 8 последовательных разведении образцов в лунках планшетов, сенсибилизированных антигеном. В качестве отрицательного контроля используют нормальную мышиную сыворотку мышей линии BALB/c. Титр антител асцитной жидкости составляет 10 -10.

Для определения титра антител в ймму- нофлюоресцентном анализе делают 6 последовательных разведении асцитной жидкости с 10-кратным шагом (1:10 - IjlO6)., Для разведения используют физиологический раствор NaCI. содержащий 0,05% тви- на-20, Пробы антител в разведениях в объеме 10 микролитров наносят на предметное стекло-с предварительно фиксированными на нем микробными клетками. Стекла выдерживают при комнатной температуре в течение 30 минут, ополаскивают физиологическим раствором. Реакцию про- ;являют препаратом кроличьего анти Мы- шинного глобулина меченого ФИТЦ в рабочем разведении (производство ИЭМ АМН СССР). Через 20-30 минут инкубации стекло отмывают физиологическим раствором, затем дистиллированной водой, высушивают и просматривают под масляной иммерсией в люминесцентном микроскопе. Положительной считается реакция имму- нофлюоресценции, оцениваемая на 2+и выше при 4-балльной системе оценки. Титр антител в асцитной жидкости гибридного штамма составляет в ИФлА 5х103 - 10.

Специфичность моноклинальных антител к поверхностному антигену типичных штаммов возбудителя сапа подтверждается данными, приведенными в табл.1.

Моноклональные антитела, продуцируемые штаммом гибридных культивируемых клеток мыщи ВСКК(П)275Д, полученные из культуральных и асцитных жидкостей, высаливают растворен сульфата аммония при 50.%-ном насыщении, подвергают диализу против фосфатно-солевого буфера с последующей лиофилизацией и хранят при температуре 4°С в течение года без потери активности.

П р и м е р 2. Использование монокло- нальных антител, полученных на основе предложенного штамма, для определения поверхностного антигена типичных штаммов возбудителя сапа в ИФлА и реакции 5 непрямой гемагглютинации.

Для выявления возбудителей сапа на стекле с предварительно фиксированными клетками исследуемых штаммов или мазками-отпечатками органов наносят 5-ТО мик- 0 ролитров антител в разведении, в 2-5 раз . меньшем титра, установленного при оценке их активности. Стекла выдерживают в течение 30 минут при комнатной температуре и несколько раз отмывают физиологическим.; 5 раствором. После этого на стекла наносят препарат кроличьего антимышинного глобулина, меченого ФИТЦ в рабоче.м разведении. Через 20-30 минут стекла отмывают физиологическим раствором, споласкивают 0 дистиллированной водой и высушивают. Препараты просматривают в люминесцентном микроскопе при малом увеличении под масляной иммерсией, при этом микробные . -клетки возбудителя сапа показываюттипич- 5 ное свечение.

Выявление возбудителя сапа возможно также при помощи реакции непрямой гемаг- . глютинации. Диагностикум сапной эритро- цитарный, приготовленный на основе 0 моноклональных антител, позволяет обнаруживать в РИГА 8x106 - 6x107 м.т./мл P.maliei, что несколько ниже чувствительности стандартного группового эрИтр дЦиТар ного препарата, приготовленного на основе 5 поликлональных сывороток, однако имеет преимущество перед последним по спёцй- , фичности(табл.2).

Штамм гибридных культивируемы клеток мыши продуцирует мбнбклональные ан- 0 титела, позволяющие получать высокоспецйфичные результаты при определении P.mallei в реакциях ИФлА и непрямой гемагглютинации. Данные методы быстры и экономичны, поскольку при опре- 5 делении возбудителя сапа нет необходимости прибегать к используемому в настоящее время набору тестов, основанному на сравнении биохимических и культуральных свойств микроорганизмов рода 0 Pseudomonas.

Формула изобретения Штамм гибридных культивируемых клеток Mus muscufus L ВСКК(П) № 275Д - продуцент моноклональных ангмтеп к 5 поверхностному антигену типичных штаммов возбудителя сапа Pseudomonas mallef.

uМузейные штаммы, изученные в ИФлА

Возбудитель сапа - P. mallei (12 штаммов) Возбудитель сапа (атипичные штаммы) Возбудитель мелиоидоза - Ps. pseudomallel (58 штаммов)

Гетерологичные микроорганизмы(19 штаммов).

Примечание. В качестве гетерологичных видов микроорганизмов были использованы: P.aeruglnosa Н-1, Н-5, Н-12; P.putlda ВКМВ-1301; P.stutzerl 4136: P.cepacla 3181,8236, 8237; P.fluorescenc С-2234, 4125; P. pseudoalcallgenes BKMB-1300; Aeromonas B-47. B-48; S.typhi 14600, S.paratyphl A-27 B-493; Sh.Sonnt 20; E.coll 0,2, 0-11.

Музейные штаммы

Концентрация выявленных микроорганизмов

1 сут. культивирования

P. mallei (13 штаммов) Атипичные штаммы P. mallei (2 штамма) Р . pseudotnallef (42 штамма) Р . pseudomallel VPA Гетерологичные микроорганизмы(19 штаммов)

Таблица 1

Интенсивность флуоресценции в положительных пробах

12/12 0/3

4+

1/58

3+

0/19

Таблица 2

2 сут. культивирования

8х106-6хЮ7

8x10е

4x10°