Изобретение относится к гибридомной технологии и касается получения гибридного клона - продуцента моноклональных антител к видоспецифическому антигену Pseudomonas pseudomallei.
До недавнего времени для диагностики, идентификации и дифференциации P.pseudomallei использовали абсорбированные моноспецифические сыворотки животных к возбудителю мелиоидоза (базовый объект), однако из-за наличия общих антигенов даже после абсорбции они давали перекрестные реакции с близкородственным возбудителем сапа (P.mallei).
Цель изобретения - получение гибридных культивируемых клеток Mus musculus L, продуцирующих специфические моноклональные антитела к антигену
Pseudomonas pseudomallei, не реагирующих с близкородственным возбудителем сапа.
Новый штамм получен с использованием традиционных приемов гибридомной технологии. Особенностью его создания является то, что для гибридизации (с помощью ПЭГ) с клетками мышиной миеломы (РЗ- Х63-А8.653) были взяты лимфоциты мышей, первично иммунизированных внутрибрю- шинно корпускулярным антигеном P.pseudomallei (1 10 м.т.) и вторично стимулированных тем же антигеном в культуре ин витро (1 10 м.т./мл). Штамм гибридных клеток ВСКК (II) 388Д депонирован и хранится в специализированной коллекции перевиваемых соматических клеток позвоночных института цитологии АН СССР
XI О
ь ел
Штамм ВСКК (II) 388Д (авторское наименование М.М.Р.рм 2 (клон 45 С4 В2) имеет следующие характеристики. Условия культивирования.
1. витро, в виде стационарной взвеси: температура 37°С, атмосфера с 5% С02 и 98% влажностью, среда Пскова - Хе- ма - RPMI (1:1:2) с этаноламином (до 300/л М) или среда RPMI-1640, содержащие 10% сыворотки плода коров, ГЕПЕС (10 мМ), 1-глю- тамин (2мМ) без антибиотиков или с добавлением до 100 ед./мл пенициллина и стрептомицина. Клетки (прозрачные, округлые иногда в виде конгломератов, распадающихся при пипетировании) рассевают через 3-4 дня с кратностью рассева 1:3 - 1:10 (оптимальная посевная доза: 150- 200 тыс.клеток в 1 мл среды).
2.Пассажи ин виво на мышах линии BALB/c, предварительно обработанных стерильным вазелиновым маслом или при- станом (по 0,5 мл внутрибрюшинно за 7 - 14 дней), осуществляют путем введения, внутрибрюшинно 3-5 106 клеток гибридного клона. На 7 - 28-й день в брюшной полости животных развивается асцит. В культураль- ной жидкости (в системе ин витро) и в асцитической жидкости (в системе ин виво) содержатся моноклональные антитела к антигену P.pseudomallei. Титр специфических иммуноглобулинов в культуральной жидкости и ИФА (иммуноферментный анализ) 1:40 - 1:160, в асцитической жидкости - 1:104- 1:105. В тесте иммунофлюоресцен- ции (при взаимодействии специфических антител с бактериями) высоленные моноклональные антитела дают реакцию с антигеном в разведении 1:20000.
Свойства антител, продуцируемых гибридным штаммом.
Моноклональные антитела относится к классу JgM. Стабильность антителопродук- ции сохраняется на протяжении 22 пассажей в культуре ин витро и на протяжении 28 пассажей при культивировании со сменой хозяина (ин виво - ин витро - ин виво) (срок наблюдения).
При сравнительном испытании в ИФА и реакции иммунофлюоресценции (прямой и непрямой) продуцируемые гибридными клетками моноклональные антитела взаимодействуют с антигеном P.pseudomallei и не взаимодействуют с антигенами близкородственного возбудителя сапа (P.mallei), т.е. обладают строгой видоспецифичностью к возбудителю мелиоидоза. Это было подтверждено и при сравнительном испытании антител с наборами типовых музейных штаммов: антитела реагировали со всеми испытанными типичными штаммами
P.pseudomallei и не реагировали ни с одним
из испытанных типичных штаммов P.mallei.
Использование продукта полученного
нового штамма гибридных клеток - моноклональных антител к видоспецифическому антигену P.pseudomallei,
Моноклональные антитела получаютли- бо из культуральной жидкости (при культивировании ин витро), либо из
0 асцитической жидкости (при культивировании гибридом ин виво). Для демонстрации их избирательной (в отношении возбудителя мелиоидоза) специфичности используют метод иммуноферментного анализа, пря5 мой и непрямой иммунофлюоресценции. Иммуноферментный анализ. В качестве антигена на твердой фазе для сравнительного анализа в ИФА используют водно-солевые экстракты из взвесей
0 инактивированных бактерий (двухсуточные культуры либо P.mallei либо P.pseudomallei, типичных штаммов, обладающих полным набором антигенов, присущих каждому виду), подвергнутых обработке ультразвуком и
5 осветлению центрифугированием. Для сенсибилизации планшетов используют предварительно подобранные оптимальные дозы суммарных антигенов (20 мкг/мл в кар- бонат-бикарбонатном буфере, рН 9,6), сен0 сибилизация - в течение ночи при 4°С.
В таблице содержатся данные сравнительного тестирования в ИФА продуцируемых гибридными клонами моноклинальных антител на разных антигенах (суммарные
5 антигены возбудителя сапа или мелиоидоза),
Из таблицы видно, что антитела гибридного штамма взаимодействовали с антигеном возбудителя мелиоидоза и не
0 реагировали с антигенами возбудителя сапа, Лишь в низких разведениях асцитиче- ских жидкостей 1:20 - 1:80 возможно положительная реакция на уровне фона, видимо, за счет неспецифического связывания
5 сывороточных антител. В высоких разведениях при наличии положительной реакции со специфическим антигеном перекрестные реакции с антигенами сапа отсутствовали. Не было перекрестных реакций и при тести0 ровании антител гибридного клона из су- пернатанта культур (при выращивании гибридом ин витро). Напротив моноклональные антитела к Л ПС возбудителя мелиоидоза реагировали и с суммарными
5 антителами возбудителя сапа и возбудителя мелиоидоза, демонстрируя факт, что Л ПС является общим антигеном для обоих возбудителей. Взятые в качестве отрицательного контроля моноклональные антитела к дифтерийному анатоксину не реагировали ни с
одним из антигенов. Таким образом, в ИФА с помощью предлагаемых антител возможна дифференциация данных возбудителей.
Метод непрямой иммунофлюоресцен- ции,
На предметных стеклах в два ряда делают мазки из взвесей бактерий возбудителей мелиоидоза и сапа, фиксируют и наносят на них капли серий разведений моноклональ- ных антител. В контроле - заведомо реаги- рующие (+) или нереагирующие (-) антитела. Проводят инкубацию во влажной камере, отмывают физиологическим раствором, добавляют меченые флюоресцирующие антитела к иммуноглобулинам мыши в рабочем разведении, инкубируют, отмывают, высушивают, просматривают под иммерсией. Положительными считают мазки с наличием флюоресценции микробной стенки, При испытании моноклинальных антител предла- гаемого гибридного штамма установлено, что они не дают флюоресценции при испытании на корпускулах возбудителя сапа и дают отчетливую флюоресценцию корпускул возбудителя мелиоидоза (в разведении до 1:20000).
Метод прямой иммунофлюоресценции,
Моноклональные антитела по общепринятой методике конъюгируют с флюоресце- инизотиоцианатом и используют в тесте прямой имуннофлюоресценции с возбудителем мелиоидоза. Установлено, что при конъюгации с флюоресцеинизотиоциана- том специфическая активность монокло- нальных антител не уменьшается. При анализе серий музейных штаммов обоих возбудителей в тестах прямой и непрямой иммунофлюоресценции было установлено,
что предлагаемые антитела реагируют с возбудителями мелиоидоза и не реагируют с возбудителями сапа, т.е. обладают выраженной видоспецифичностью.
Высокая специфичность моноклональ- ных антител, продуцируемых предлагаемым штаммом клеток (видоспецифичность) позволяет в одной реакции (реакция иммунофлюоресценции, ИФА) обеспечить раннюю диагностику, идентификацию возбудителя мелиондоза и его дифференциацию от близкородственного возбудителя сапа. В то время как использовавшиеся ранее для этих целей абсорбированные моноспецифические сыворотки к возбудителю мелиоидоза (базовый объект) дают перекрестные реакции с возбудителем сапа, предлагаемые антитела обладают видоспецифичностью. Данные антитела (продукт предлагаемого гибридного штамма) можно рассматривать как высокоактивный и специфичный ингредиент для постановки реакций непрямой иммунофлюоресценции и как сырье для изготовления флюоресцирующих иммуноглобулинов для постановки реакции прямой иммунофлюоресцении.
Таким образом, новый штамм обеспечивает получение более эффективного препарата, пригодного для идентификации возбудителя особо опасной инфекции - ме- лиодоза.
Формула изобретения
Штамм гибридных культивируемых клеток животных Mus musculus L., BCKK(II) № 388Д - продуцент моноклинальных антител к антигену Pseudomonas pseudomallei, не реагирующих с близкородственным возбудителем сапа.
Использование: биотехнология, иммунология. Сущность изобретения: штамм получают путем слияния с помощью поли- этиленгликоля клеток мышиной миеломы РЗ-Х63-А.8.653 с лимфоцитами мышей Balb/c. Штамм депонирован в Специализированной коллекции перевиваемых соматических клеток позвоночных института цитологии АН СССР под номером ВСКК (II) 388Д. Штамм продуцирует моноклональные антитела (МКА) тип a IgM, титр МКА в культу- ральной жидкости - 1:40 - 1:160, в асцити- ческой жидкости - 1:104 - 1:105. МКА взаимодействуют с типичными штаммами Pseudomonas pseudomalleei и не взаимодействуют с типичными штаммами Pseudomonas mallei. Стабильность антителопродукции сохраняется в течение 28 пассажей без потери активности. МКА используют для идентификации возбудителя мелиоидоза. 1 табл. (Л
Результаты тестирования в ИФА препаратов моноклинальных антител клоча 8СКК (II) 368 Л (супернатант из культуры гибридных клеток или смесь асцитических жидкостей от мышей с гибридо цм&а планшетах сенсибилизированных либо суммарными антигенами возбудителя сапа, либо суммарными антигенами возб,- дителя мелиоидоза
| Журнал микробиологии, эпидемиологии, иммунобиологии, 1981, №4, с.78. |
