Способ культивирования продуцента бета-экзотоксина Советский патент 1993 года по МПК A01N63/00 C12N1/20 

Изобретение относится к области биотехнологии, в частности к способам производства биологических инсектицидных препаратов и может быть использовано для производства СЭР или защиты животных.

Ряд штаммов энтомопатогенного мик- , роорганизма Bacillus тЬиг1пд1еп$15(далее ВТ) в процессе их культивирования выделяют в культуральную жидкость водорастворимый экзотоксин. Выход экзотоксина зависит от состава питательных сред и может быть увеличен соответствующим его подбором.

Для осаждения экзотоксина из культуральной жидкости ВТ после полного созре- вания спор предложен способ концентрирована экзотоксина. Для этого в фильтрат (либо в фугат) культуральной жидкости (КЖ) вносят соли бария либо кальция, связывающие экзотоксин.

Целью настоящего изобретения является увеличение выхода бета-экзотоксина

сравнительно экономными средствами и уменьшение времени ферментации.

Наиболее близким к предлагаемому способу культивирования продуцента бета- экзотоксина является способ получения би- токсибациллина, заключающийся в культивировании штамма-продуцента экзотоксина на среде, содержащей источник углерода, азота в присутствии соли, образующей нерастворимый комплекс с бета-экзотоксином. В качестве последней применяют уксуснокислый кальций. Максимально достигнутый выход экзотоксина при реализации данного способа 1232-1480 мг/л при расходе уксуснокислого кальция до 65 г/л (6,5 вес.%).

Поставленная нами цель - увеличение выхода бета-экзотоксина при снижении расхода солей, связывающих бета-экзотоксин в водонерастворимый комплекс, а также уменьшение продолжительности цикла ферментации достигается осаждением экзоток

ю го

сина, выделяемого в процессе культивирования ВТ путем внесения 0,6-0,7 мг BaCte на 1 л КЖ или 1,0-1,1 мг CaClz на 1 л КЖ в культуральную жидкость ВТ на стадии максимальной физиологической активности. Причем, если необходим препарат, содержащий только экзотоксин, процесс ферментации прекращается с выходом культуры в стационарное состояние роста.

Указанные добавки образуют стойкие комплексы металл-экзотоксин и тем самым выводят последний из реакции. При этом с одной стороны, снижается ингибирующее действие экзотоксина на рост микроорганизмов ВТ, с другой - связанный экзотоксин не может расходоваться для вторичного метаболизма бактерий.

Соли бария или кальция следует вносить на 10-16 ч культивирования, что соответствует зоне максимальной скорости роста микроорганизмов, поскольку в это время максимальна и скорость накопления экзотоксина в КЖ.

Наиболее предпочтительно использование солей бария, поскольку степень связывания этого металла с экзотоксином наибольшая.

Процесс накопления экзотоксина заканчивается на стадии выхода культуры в стационарное состояние кривой роста, поэтому при получении только экзотоксинсо- держащего препарата дальнейшее культивирование не требуется.

При получении смешанного экзотоксин и экзотоксинсодержащего препарата культивирование проводят исходя из степени и скорости накопления эндотоксина.

Ниже приведены примеры конкретного исполнения.

П ри м е р 1-14. Культивирование штамма ВТ 98-1с проводили в ферментаторе АН- КУМ-2 на среде состава: белково-витаминный концентрат (БВК)3.6% кукурузная мука 2,8 % соевая мука 0,5 % мел 0,3 % начальное значение рН среды составляло 7,2 объем среды 1,0л скорость перемешивания 400 об/мин расход воздуха на аэрацию 1 л/сек температура 30°С Во всех вариантах условий эксперимента культивирование начинали с вывода аппарата АНКУМ-2 на режим. В качестве инокулята использовали смыв стерильным физраствором объемом 30 мл с косяка культуры ВТ-98-1с, прогретый в термобане при температуре 80°С в течение 5 мин. Культивирование вели с контролем температуры, рН среды, р Оа времени культивирования.

Физиологическое состояние клеток контролировали микроскопированием отобранных проб. Добавки водного раствора хлористого бария или водного раствора хлористого бария или водного раствора хлористого кальция, а также продолжительность эксперимента проводили согласно схемы условий эксперимента 1-14.

По завершении каждой ферментации проводили анализ КЖ на содержание экзо

токсина в осадке, в растворе и суммарное

содержание экзотоксина. Содержание экзотоксина определяли с помощью тонкослойной хроматогрзфии и спектрофотометрии по методике (3). Погрешность измерений со- 0 держания экзотоксина составила ±0,05 г/л. Эксперименты проводили по следующей схеме:

1. Культивирование ВТ 98 при условиях, описанных выше,-время культивирования 5 20 ч добавки не вносились (контроль).

2. Культивирование ВТ 98-1 с как в (1), но внесено 1,8 мл 30 %-ного водного раствора хлористого бария (0,5 мг) на 1 л КЖ через 16 ч культивирования.

0 з. То же, что и (1), но внесено 2,0 мл 30 %-ного водного раствора хлористого бария (0,6 мг) на 1 л КЖ через 16 ч культивирования.

4. То же, что и (1), но внесено 2,3 мл 30 5 %-ного водного раствора хлористого бария (0,7 мг) на 1 л КЖ через 16 ч культивирования.

5. То же, что и (1), но внесено 1.5 мл 60 %-ного водного раствора хлористого каль- 0 цця (0,9 мг) на 1 л КЖ через 16ч культивирования,

6. То же, что и (1), но внесено 1,7 мл 60 %-ного водного раствора хлористого кальция (1,0 мг) на 1 л КЖ через 16 ч культивиро- 5 взния.

7. То же, что и (1), но внесено 1,9 мл 60 %-ного водного раствора хлористого кальция (1,1 мг) на 1 л КЖ через 16ч культивирования.

08. Культивирование ВТ 98-1с, что и (1), но время культивирования 48 ч (контроль).

9. 9, 10, 11, 12, 13, 14-то же, что и 2, 3, 4, 5, 6, 7 соответственно, но время культивирования 48 ч.

5 Результаты экспериментов представлены в таблице.

Из таблицы следует, что содержание экзотоксина в КЖ после 20 ч культивирования превышает содержание экзотоксина в КЖ после 48 ч культивирования на 45 %.

Внесение в КЖ на 16 ч (при 20-часовом культивировании) раствора хлористого бария увеличивает содержание экзотоксина на 65%, а раствора хлористого кальция - на 36 %. Внесение хлоридов бария или каль- ция на 16 ч (при 48-часовом культивировании) также способствует увеличению выхода экзотоксина в сравнении с контролем соответственно от 72 % (BaCte) до 46 % (CaCte) однако, в количественном отноше- нии выход экзотоксина в этом случае ниже, чем содержание экзотоксина, зарегистрированное при 20-часовом культивировании с внесением тех же добавок хлоридов бария или кальция.

Таким образом, для достижения максимальной концентрации экзотоксина в препарате необходимо ввести указанные добавки на 16 ч от начала культивирования и закончить процесс ферментации на 20 ч.

При 48-часовой ферментации число жизнеспособных спор не зависит от введения солей металлов, содержание экзотоксина при наличии последних увеличивается примерно в 1,5-2 раза.

Предлагаемый нами способ культивирования продуцента бета-экзотоксина был проверен и на среде другого состава, в частности, предложенного авторами заявки.

Основные компоненты среды: источни- ки углерода, азота, лизин сохранялись согласно предложенной рецептуре, а соли, образующие с бета-экзотоксином нерастворимый комплекс, вносили не вначале ферментации, как предлагают авторы изобретения, а на стадии роста, соответствующей максимальной физиологической активности (10-16 ч), причем вместо уксуснокислого кальция использовались соли либо кальция, либо бария в концентраци- ях, предлагаемых нами в данной заявке (Примеры 15 и 16).

П р м м е р 15. Штамм ВТ98-1с выращивали на среде, объемом 1 л, содержащей белково-витаминный концентрат (БВК) - 3 %, гидролизат кормовых дрожжей с содержанием растворимого белка 50 мг/л, гидролизат рапсового шрота с содержанием растворимого белка 8 мг/л, лизин кристаллический (0,002 вес.%) при 30°С, аэрации 1 л/мин, скорости перемешивания 400 об/мин. На 10-16 ч культивирования, что соответствовало максимальной физиологической активности продуцента, внесли 2 мл 30 %-ного водного раствора хлористого бария. На 20 ч процесс культивирования остановили.

Содержание растворенного экзотоксина в КЖ составило: в осадке - 0,92 г/л, в растворе - 0,73 г/л, суммарно - 1,65 г/л.

П р и м е р 16. Штамм ВТ 98-1с культивировали на среде того же состава, что и в примере 15. По истечении 16 ч с начала культивирования внесли 1,7 мл 60 %-ного водного раствора хлористого кальция. На 20 ч культивирования содержание экзотоксина составило: в осадке - 0,9 г/л, в растворе - 0,6 г/л, суммарное количество - 1,5 г/л.

Использование предлагаемого способа получения экзотоксина в процессе культивирования ВТ обеспечивает следующие преимущества: если исчерпаны все возможности увеличения выхода экзотоксина оптимизацией состава сред на данном штамме, выход может быть увеличен еще до 70% введением раствора BaCla (или CaCte) ориентировочно на 16 ч роста и прекращением процесса культивирования на 20 ч.

Таким образом, использование предлагаемого способа получения экзотоксина обеспечивает следующие преимущества: увеличение выхода экзотоксина на 70%, уменьшение времени ферментации на 45%, а также существенное уменьшение расхода солей, связывающий бета - экзотоксин в водонерастворимый комплекс.

Экономический эффект от внедрения предлагаемого изобретения будет обеспечиваться увеличением выхода экзотоксина и снижением технологических затрат при ферментации, и в масштабах СССР составит не менее 700 тыс. руб. в год при уровне рентабельности 33%.

Использование: биотехнология, производство инсектицидных препаратов. Сущность изобретения: продуцентбета- экзотоксина штамм бактерий Вас. thurlnglensls 98-1 с культивируют на среде, содержащей источники углерода и азота до стадии физиологической активности роста продуцента, в частности в течение 16 ч, затем вводят хлористый барий в количестве 0,6-0,7 мг/л или хлористый кальций в количестве 1,0-1,1 мг на 1 л культуральной среды и продолжают культивирование до выхода культуры в стационарную фазу роста. 1 табл.

Формула изобретения Способ культивирования продуцента бета-экзотоксина на питательной среде, содержащей источники углерода и азота, в присутствии соли, образующей нерастворимый комплекс с бета-экзотоксином, отличающийся тем, что, с целью повышения выхода целевого продукта при снижении расхода соли и времени культивирования, в

качестве соли используют хлористый барий в количестве 0,6-0,7 мг/л или хлористый кальций в количестве 1,0-1,1 мг на 1 л куль- туральной жидкости, причём соль вводят в процессе культивирования на стадии максимальной физиологической активности роста продуцента, а процесс культивирования ведут до выхода культуры в стационарную фазу.

СОДЕРЖАНИЕ ЭКЗОТОКСИНА В КЖ В ЗАВИСИМОСТИ ОТ ВНЕСЕНИЯ СОЛЕИ МЕТАЛЛОВ