ШТАММ БАКТЕРИЙ PSEUDOMONAS PUTIDA - ДЕСТРУКТОР НЕИОНОГЕННЫХ ПОВЕРХНОСТНО-АКТИВНЫХ ВЕЩЕСТВ Российский патент 1996 года по МПК C12N1/20 C12N1/20 C12R1/40 

Изобретение относится к области микробиологической промышленности и заключается в получении нового штамма бактерий.

Одним из крупномасштабных загрязнителей окружающей среды являются поверхностно-активные вещества (ПАВ), в том числе и неионогенные (НПАВ). Поэтому деградация НПАВ как в сточных водах, так и в объектах окружающей среды является весьма актуальной задачей. Одним из наиболее перспективных способов удаления ПАВ является микробная деструкция, основанная на использовании микроорганизмов, способных в качестве единственного источника углерода и энергии использовать поверхностно-активные ксенобиотики.

Известны зарубежные аналогичные штаммы-деструкторы НПАВ (пат. США N 4317885, Японии N 54-36674). Их недостатком является неспособность к деградации оксиэтилированных алкилфенолов (ОЭАФ), одних из наиболее трудноразлагаемых НПАВ. Известен также штамм-деструктор ОЭАФ (пат. США N 4483923). Его недостатком является недостаточно высокая активность: при концентрации ОЭАФ 200 мг/л и при периодическом культивировании убыль вещества составляет 40% за неделю, при концентрации 500 мг/л и непрерывном культивировании 88% за 41,5 ч.

Известны отечественные аналогичные штаммы-деструкторы НПАВ [4,5] отличаясь высокой деструктивной активностью по отношению к ряду НПАВ, они не разрушают ОЭАФ.

Наиболее близким к заявленному штамму по деструктивной активности является штамм Pseudomonas putida ТШ-18 [6] При периодическом культивировании на синтетической среде следующего состава (г/л): Na₂HPO₄ 6,0; KH₂PO₄ 3,0; NH₄Cl 1,0; NaCl 0,5; pH 7,2, штамм проявлял высокую деструктивную активность по отношению к ОЭАФ, добавляемому в среду в качестве единственного источника углерода и энергии (см. табл. 1).

Таким образом, у прототипа биодеградация ОЭАФ не превышала 87 88% за 41 48 ч при концентрации 0,5 г/л и достигала 100% за 24 ч лишь при концентрации 0,2 г/л.

Целью изобретения является выделение штамма с повышенной деструктивной активностью и широким субстратным спектром.

Предлагаемый штамм Pseudomonas putida ТП19 депонирован в центральном музее промышленных микроорганизмов под N ВКПМ В-6582 и характеризуется следующими свойствами.

Морфологические признаки. В мазках грамотрицательные палочки, короткие, располагающиеся поодиночке или короткими цепочками, спор и капсул не образуют, подвижные.

Культуральные свойства. Прототроф. Хороший рост на простых питательных средах. Оптимум роста 25 30^oC. При 42^oC рост отсутствует. На мясо-пептонном агаре колонии выпуклые, правильной округлой формы, блестящие, бесцветные. Диаметр колоний после 24 ч роста 1 2 мм. Рост при посеве уколом в столбик интенсивный на поверхности, на мясо-пептонном бульоне хороший с тонкой пленкой на поверхности.

Физиолого-биохимические свойства. Оксидазопозитивен. Продуцирует каталазу, аргинингидролазу, нитратредуктазу. Не образует уреазу, лецитиназу, желатиназу, орнитиндекарбоксилазу, фенилаланиндезаминазу, индол, сероводород. На OF среде с глюкозой и мальтозой наблюдается кислотообразование, с рамнозой, арабинозой, сахарозой, ксилозой кислотообразование не отмечается.

В качестве источника углерода и энергии использует цитрат.

Не растет в присутствии 6,5% NaCl. Отсутствует рост на безазотистой среде Эшби и среде Чапека. Не гидролизует крахмал. Не образует пиоцианин на среде Кинг А, образует флуоресцентные пигменты на среде Кинг В. Растет на среде Плоскирева. Не вызывает гемолиз эритроцитов.

Чувствительность к антибактериальным препаратам. Штамм устойчив к пенициллину, оксациллину, ампициллину, карбенициллину, эритромицину, олеандомицину, линкомицину, ристомицину, фузидину, левомицетину; штамм чувствителен к тетрациклину, доксициклину, стрептомицину, мономицину, гентамицину, канамицину, неомицину, полимиксину.

Патогенные свойства. При внутрибрюшинном заражении беспородных белых мышей (10 животных) взвесью суточной культуры штамма в количестве 1 млрд микробных тел в 0,5 мл физиологического раствора на животное заболевания не обнаружено. Срок наблюдения 10 дн. Это дало основание считать культуру непатогенной.

Условия хранения. Культуру хранят на столбиках с полужидким 0,6% агаром под слоем стерильного вазелинового масла при 4^oC, пересевая 2 раза в год.

На основании комплекса морфолого-культуральных и физиолого-биохимических свойств штамм был идентифицирован как Pseudomonas putida.

Пример 1. Получение штамма ТП-19. Микроорганизм деструктор НПАВ выполнен методом накопительной культуры из микробного консорциума активного ила. Материал в количестве 1 мл вносят в колбу Эрленмейера емкостью 500 мл, содержащую 100 мл синтетической среды М9 следующего состава (г/л): Na₂HPO₄ 6,0; KH₂PO₄ 3,0; NaCl 0,5; NH₄Cl 1,0; pH 7,2. В среду добавляется тритон Х-100 в концентрации 0,5 г/л. Культивирование проводится на качалке при 160 об/мин и температуре 28^oC. Через 3, 5, 10 сут из накопительной культуры отбирают пробы, которые высевают на агаризованную синтетическую среду того же состава. Одновременно пробы анализируют на деструкцию тритона и с помощью чашечных экспресс-методов выделяют чистые культуры бактерий. Деструктивную активность выделенных опять проверяют в жидкой синтетической среде. Количественное определение НПАВ проводили колориметрическим методом с фосфорномолибденовой кислотой (Клименко Н.А. Панченко Н.П. Текстильная промышленность, 1971, N 2, c. 85 86). Культуры отсевают на столбики с полужидким агаром и хранят под слоем вазелинового масла при 4^oC. Идентификацию проводили общепринятым способом (Buchanan and Gibbons (editors) Bergey's manual of determinative bacteriology, 8 th ed. The Williams and Wilkins Co. Baltimore, 1974).

Пример 2. Деструкция неионогенных и оксиэтилированных анионных ПАВ при периодическом культивировании штамма Ps. putida ТП 19. Культивирование проводят в среде М9 ПАВ добавляют в концентрации 0,5 1,0 г/л. Исходная концентрация клеток составляет 5•10⁸ кл/мл (0,70D₄₄₀). Инкубируют при 28^oC на качалке при 160 об/мин. Контроль осуществляют колориметрическим методом. Результаты деструкции приведены в таблице 2.

Пример 3. Деструкция повышенных концентраций тритона Х-100 штаммом Ps. putida ТП19 при периодическом культивировании. Культивирование проводилось в среде М9 при 28^oC на качалке при 160 об/мин. Исходная концентрация клеток составляла 7 10⁹ кл/мл. Тритон х-100 вносился в концентрации 5 10 г/л. Убыль вещества определялась через 24 ч инкубации. При концентрации тритона 5 г/л убыль составляла 98% при концентрациях 7 и 10 г/л 95 и 90% соответственно.

Пример 4. Деструкция НПАВ синтанола ДС-10 и неонола АФ₉-12 штаммом ТП19 при непрерывном культивировании. Непрерывное культивирование в лабораторных условиях осуществлялось в модельном растворе, представляющим собой минеральную среду М9, содержащую синтанол или неонол в концентрации 0,5 г/л. Процесс осуществлялся в биореакторе в условиях проточного культивирования. Аэрация осуществлялась компрессором при подаче воздуха 1 л/л среды в мин, температура составила 25^oC. Модельный раствор подается в биореактор со скоростью 0,04 ч^-1. Для засевания биореактора установки культурой деструктора, последнюю выращивают на мясо-пептонном агаре и полученную биомассу иммобилизуют на носителе в установке. Очищенная вода содержит НПАВ в концентрации 5 15 мг/л, что не превышает предельно-допустимых концентраций этих соединений для сброса на городские очистные сооружения. Эффективность очистки от синтанола и неонола при непрерывном культивировании составляет таким образом 97 99%
Таким образом, предлагаемый штамм ТП19 обладает деструктивной активностью по отношению к различным классам НПАВ при их концентрации 0,5 1,0 г/л; за 24 ч при периодическом культивировании оксиэтилированные жирные кислоты разрушаются на 65% оксиэтилированные спирты на 85 98% оксиэтилированные алкилфенолы на 65 98% оксиэтилированные амиды на 90% и оксиэтилированные АПАВ на 60% Отдельные представители ОЭАФ, в частности тритон х-100 разрушается на 90% при концентрации его до 10 г/л. При непрерывном культивировании эффективность разрушения НПАВ штаммом повышается для синтанола ДС-10 с 86 до 98% и для неонола АФ₉-12 c 87 до 98%
Таким образом, предлагаемый штамм обладает значительно большей деструктивной активностью по отношению к ОЭАФ и обладает более широким деструктивным спектром по сравнению с известными.

Использование: относится к области микробиологии и биотехнологии. Сущность изобретения: заключается в выделении нового штамма, который обладает деструктивной активностью по отношению к различным классам НПАВ. 2 табл.

Штамм бактерий Pseudomonas putida ВКПМ В-6582 деструктор неионогенных поверхностно-активных веществ.