ШТАММ БАКТЕРИЙ CORYNEBACTERUM SPECIES-ДЕСТРУКТОР АРОМАТИЧЕСКИХ СОЕДИНЕНИЙ Российский патент 1996 года по МПК C12N1/20 C02F3/34 C12N1/20 C12R1/15 

Изобретение относится к области прикладной микробиологии и биотехнологии и заключается в выделении нового штамма бактерий, способного утилизировать 2,4-динитрофенол и другие ароматические соединения. Штамм может быть использован для очистки сточных вод различных производств, содержащих не только 2,4-динитрофенол, но и другие ароматические вещества, входящие в спектр активности этого штамма: 2,4,6-тринитрофенол, фенол, бензойная кислота, ее оксипроизводные. Все эти соединения входят в состав сточных вод производства различных красителей, взрывчатых веществ, антисептиков и предприятий основного органического синтеза. Кроме того, 2,4-динитрофенол и его производные содержатся в сточных водах производства ряда гербицидов и инсектицидов контактного действия.

Эти вещества отличаются высокой устойчивостью к воздействиям окружающей среды, но особенно это относится к 2,4-динитрофенолу. Это высокотоксичное соединение имеет ПДК 0,05 мг/л. ПДК 2,4,6-тринитрофенола 0,5 мг/л, ПДК фенола 0,001 мг/л.

Динитрофенолы являются биологически резистентными соединениями, поэтому известны лишь указания на возможность их утилизации различными микроорганизмами. Например, штамм Pseudomonas sp. способен за 35 дней снижать концентрацию 2,4-динитрофенола в среде с 285 мг/л до 220 мг/л (1). Известен штамм Arthrobacter X (2), обладающий достаточно широким спектром действия, включающим помимо 2,4-динитрофенола 2,4,6-тринитрофенол и 2,6-динитро-о-крезол. Однако 70 мг/л 2,4-динитрофенола разрушается этим штаммом за 7 дней на 42-45%
Недостатком указанных штаммов является отсутствие у них способности полно и за достаточно короткий срок разлагать 2,4-динитрофенола при высоком содержании в среде культивирования.

Наиболее близким к заявляемому является штамм Nocardia аlЬа (3), разрушающий 2,4-динитрофенол в концентрации до 200 мг/л за 4 суток, однако он имеет узкий спектр действия.

Целью изобретения является получение штамма бактерий с высокой активностью, включающего в спектр действия кроме 2,4-динитрофенола и другие ароматические соединения.

Предлагаемый штамм ПНК-2 депонирован в коллекции промышленных микроорганизмов ВНИИ генетика под регистрационным номером В-5439.

Предлагаемый штамм характеризуется следующими морфолого-культуральными и физиолого-биохимическими свойствами.

Морфологические признаки. Молодые клетки представляют собой длинные и крупные грамположительные палочки, расположенные беспорядочно, в старых культурах палочки распадаются на более короткие сегменты, спор и капсул не образуют.

Культуральные свойства. Прототроф, аэроб, клетки неподвижны, оптимальная температура роста 30^oС, рост на МПА слабый через 5-6 суток диаметр колонии достигает 1 мм. Колонии на МПА круглые, непрозрачные, с ровным краем, белые поверхность выпуклая, гладкая блестящая. Пигмент не образуется, консистенция плотная, на синтетической агаризованной среде образуются аналогичные колонии, на МПБ образуется гранулированная пленка на поверхности и рыхлый осадок на дне.

Биохимические свойства. Штамм образует каталазу уреазу, желатиназу, нитратредуктазу, не образует оксидазу, лизиндекарбоксилазу, орнитиндекарбоксилазу, аргининдигидролазу, фенилаланиндезаминазу. Способен к росту при 6,5% NаCl. На среде Хью-Лейфсона не образует кислоту из глюкозы, инозита, мальтозы, сорбита, сахарозы, ксилозы, арабинозы, дульцита, маннита, галактозы, раффинозы. В качестве единственного источника углерода может использовать оксалат, аспарагиновую кислоту, глицерин, ксилозу, лактозу, глюкозу, арабинозу, мальтозу, галактозу, L-аланин, маннит, сорбит, инозит, сукцинат.

Чувствительность к антибактериальным препаратам.

Штамм ПНК-2 чувствителен к олеандомицину, мономицину, ристомицину, эритромицину, бензилпенициллину, линкомицину, левомицетину, гентамицину, тетрациклину, карбенициллину, стрептомицину, рифампицину. Устойчив к полиниксину.

Условия хранения. Стерильные столбики с синтетической минеральной средой М9 следующего состава (г/л): Nа₂НРО₄ 6,0; КН₂РО₄ - 3,0; NН₄Сl 1,0; NaCl 0,5, с добавлением 7,5 г/л агар-агара и 0,5 г/л м-оксибензойной кислоты, засевают уколом, инкубируют при 30^oС 72-96 часов, заливают 1 мл стерильного вазелинового масла и хранят при +4^oС. Пересевы 2 раза в год.

Патогенные свойства. Стандартным методом было установлено, что культура данного штамма непатогенна.

На основании комплекса морфолого-культуральных и физиолого-биохимических свойств штамм был идентифицирован как Corynebacterium species.

Пример 1. Получение штамма ПНК-2.

Штамм Corynebacterium species ПНК-2 был выделен из почвенной пробы, взятой с территории химического комбината, методом накопительной культуры. 10 г почвы вносились в 100 мл среды М9 с добавлением в качестве единственного источника углерода и энергии 2,4-динитрофенола в концентрации 200 мг/л. Только путем высева на агаризованную среду М9, содержащую 0,5 г/л м-оксибензойной кислоты удалось выделить штамм, способный утилизировать 2,4-динитрофенол в этой концентрации. Многократным пассированием через жидкую минеральную среду М9, содержащую 2,4-динитрофенол в повышающихся концентрациях, удалось повысить активность выделенного штамма до 600 мг/л.

Пример 2. Использование штамма ПНК-2 в качестве деструктора 2,4-динитрофенола в концентрации 200 мг/л в условиях периодического культивирования на круговой качалке.

Суточную культуру штамма ПНК-2, выращенную на агаризованной среде М9 с добавлением 0,5 г/л м-оксибензойной кислоты, вносили в жидкую синтетическую среду следующего состава (г/л): Nа₂НРО₄ 6,22; КН₂РО₄ 0,9; NaCl 0,5, с добавлением 0,2 г/л 2,4-динитрофенола в качестве единственного источника углерода, азота и энергии. Культивирование проводили на круговой качалке (160-180 об/мин) при 30^oС. Изменение содержания 2,4-динитрофенола в среде культивирования контролировалось спектрофотометрически путем измерения оптической плотности при 360 нм.

Через 48 часов культивирования заявляемого штамма в указанных условиях концентрация 2,4-динитрофенола в среде снижалась на 98-99%
Пример 3. Использование штамма ПНК-2 в качестве деструктора 2,4-динитрофенола в концентрации 400 мг/л в условиях периодического культивирования на круговой качалке.

Изучение утилизации 2,4-динитрофенола в концентрации 400 мг/л заявляемым штаммом проводили по схеме, аналогичной изложенной в примере 2, с тем отличием, что концентрация субстрата в среде культивирования доводилась до 400 мг/л.

Через 96 часов культивирования заявляемого штамма в указанных условиях концентрация 2,4-динитрофенола в среде снижалась на 99-99,5%
Пример 4. Использование штамма ПНК-2 в качестве деструктора 2,4-динитрофенола в концентрации 600 мг/л в условиях периодического культивирования на круговой качалке.

Изучение утилизации 2,4-динитрофенола в концентрации 600 мг/л заявляемым штаммом проводили по схеме, аналогичной изложенной в примере 2, с тем отличием, что концентрация субстрата в среде культивирования доводилась до 600 мг/л.

Через 18 cуток культивирования заявляемого штамма в указанных условиях концентрация 2,4-динитрофенола в среде снижалась на 99-99,5%
Пример 5. Использование штамма ПНК-2 в качестве деструктора 2,4,6-тринитрофенола в условиях периодического культивирования на круговой качалке.

Изучение утилизации 2,4,6-тринитрофенола заявляемым штаммом проводили по схеме, аналогичной изложенной в примере 2, с тем отличием, что вместо 2,4-динитрофенола использовался 2,4,6-тринитрофенол в концентрации 200 мг/л. Изменение содержания 2,4,6-тринитрофенола проводилось методом спектрофотометрии по изменению оптической плотности при 354 нм.

Через 12 суток культивирования заявляемого штамма в указанных условиях количество 2,4,6-тринитрофенола в среде снижалось на 60%
Пример 6. Использование штамма ПНК-2 в качестве деструктора фенола в условиях периодического культивирования на круговой качалке.

Изучение процесса утилизации фенола заявляемым штаммом проводили по схеме, аналогичной изложенной в примере 2, с тем отличием, что в качестве среды культивирования использовалась синтетическая среда М9, в которую добавляли фенол в концентрации 500 мг/л. Изменение содержания фенола в среде культивирования контролировалось спектрофотометрически по изменению оптической плотности при 270 нм.

Через 96 часов культивирования заявляемого штамма в указанных условиях фенол в среде указанными методами не определялся.

Пример 7. Использование штамма ПНК-2 в качестве деструктора м-оксибензойной кислоты в условиях периодического культивирования на круговой качалке
Изучение процесса утилизации м-оксибензойной кислоты заявляемым штаммом проводили по схеме, аналогичной изложенной в примере 6, с тем отличием, что в качестве единственного источника углерода и энергии в среду культивирования М9 добавляли м-оксибензойную кислоту в концентрации 500 мг/л. Измерение содержания субстрата в среде культивирования проводилось спектрофотометрически по изменению оптической плотности при 287 нм.

Через 72 часа культивирования заявляемого штамма в указанных условиях концентрация м-оксибензойной кислоты в среде снижалась на 97-99%
Утилизация бензойной кислоты и других оксибензойных кислот происходила в аналогичных концентрациях за близкие промежутки времени.

Данные о биодеструктивной активности заявляемого штамма, а также штамма-прототипа приведены в таблице.

Сравнение биодеструктивных характеристик заявляемого штамма с прототипом показываете, что оба штамма способны утилизировать 2,4-динитрофенол в концентрации 200 мг/л за 48-72 часа. Однако от прототипа заявляемый штамм выгодно отличает способность утилизировать 2,4-динитрофенол в более высокой концентрации (до 600 мг/л), а также расширенный спектр действия, включающий в себя 2,4,6-тринитрофенол, фенол, бензойную кислоту, ее оксипроизводные.

Таким образом, заявляемый штамм обладает высокой деструктивной активностью и может быть рекомендован для локальной очистки сточных вод от 2,4-динитрофенола и других ксенобиотиков, входящих в его спектр действия. ТТТ1

Использование: изобретение относится к области прикладной микробиологии и биотехнологии. Сущность применения заключается в выделении нового бактериального штамма, который может утилизировать высокие концентрации 2,4 - динитрофенола, кроме того, 2,4,6 - тринитрофенол, фенол, бензойную кислоту, ее оксипроизводные; штамм депонирован во Всесоюзной коллекции промышленных микроорганизмов ВНИИ генетики под регистрационным номером В-5439. 1 табл.

Штамм бактерий Corynebacterum species ВКПМВ-5439-деструктор ароматических соединений.