СПОСОБ ВЫЯВЛЕНИЯ ЦИТОКИНОВ Российский патент 2002 года по МПК G01N33/84 G01N33/577 G01N33/552 

Изобретение относится к области медицинской диагностики, именно выявления экспрессии цитокинов в клетках. Среди многочисленных факторов, предопределяющих развитие тех или иных морфологических изменений особую роль играют цитокины как медиаторы межклеточного взаимодействия при иммунном ответе и воспалении, выявление которых, с высокой степенью достоверности, позволяет проводить углубленное изучение патогенеза заболевания и использовать полученные данные для назначения индивидуальной патогенетической терапии.

Известным способом выявления цитокинов в крови и ликворе является метод иммуноферментного анализа (ЕLISА), предложенный Hamish R. Michie, М.В., Kirk R. Manogue, Ph. D. David R. Spriggs, М.D., е.а. 1988. (The New England Journal of Medicine, 1988, 318, N23, 1482-3).

1. Отцентрифугированную и отфильтрованную спиномозговую жидкость фиксировали на 1% бычем сывороточном альбумине в специальных планшетах, при комнатной температуре.

2. Обрабатывали 2% бараньей сывороткой на карбонатном буфере с рН=9 при комнатной температуре.

3. Промывали в карбонатном буфере с рН=7,5.

4. Наносили антикроличью сыворотку против фактора некроза опухоли, связанную с пероксидазой хрена.

5. Наносили и инкубировали при комнатной температуре с коньюгатом антикроличьих lgG.

6. Обрабатывали O-фенилендиамином с перекисью водорода в цитратном буфере с рН=5.

Учет результатов реакции проводился в стандартном спектрофотометре при длине волны 490-600 nm.

Этот метод позволил авторам получить хорошие результаты. Однако недостатком данного метода является то, что он трудоемок и для получения результатов требуется специальное оборудование (микропланшеты и спектрофотометр), препараты невозможно длительно хранить и фотографировать. Данный метод не позволяет определить экспрессию цитокинов в клетках, без чего невозможно судить о степени их активации.

Наиболее близким к предлагаемому способу является непрямой иммунопкроксидазный метод, описанный Дж. Полак, С. Ван-Норден. Введение в иммуноцитохимию, М.: Медицина, 1986 г.:
1 - промывка срезов в буфере,
2 - обработка 0,03% раствором перекиси водорода,
3 - промывка в буфере,
4 - нанесение на мазок первых специфических антител,
5 - промывка в буфере,
6 - нанесение вторых антител, связанных с пероксидазой,
7 - промывка в буфере,
8 - обработка 0,03% раствором диаминобензидина (ДАБ),
9 - докраска гематоксилином,
10 - заключение в бальзам. Микроскопия.

Но как показывают данные литературы и собственный опыт приведенная схема лишь в общем виде отражает ход постановки методики, В зависимости от размеров, структуры и природы выявляемого антигена необходима детальная разработка всех этапов, начиная с фиксации и до нанесения диаминобензидина.

Целью предлагаемого изобретения является упрощение метода выявления цитокинов путем определения их в клетках для возможного его применения в практическом здравоохранении, оценки тяжести течения инфекционного заболевания и своевременного назначения патогенетической (антицитокиновой) терапии.

Для реализации этой цели нами впервые предложен модифицированный непрямой иммунопероксидазный метод путем использования взвеси клеток крови (мононуклеаров), нанесенных на предметное стекло. Данный метод относится к иммуноцитохимическим и основан на специфической реакции антиген-антитело. В отличие от иммуноферментного (ELISA) он отличается простотой постановки реакции, не уступая по специфичности и чувствительности, позволяет иметь постоянные препараты, поскольку интенсивность окраски не падает. Препараты можно просматривать в обычном световом микроскопе и фотографировать.

Предложенный метод отличается тем, что мазки крови перед обработкой перекисью водорода 0,03% и моноклональными антителами к цитокинам обрабатывают бихроматом калия 1%, а перед нанесением антивидового коньюгата - 0,3% Тритоном Х-100.

В рамках предлагаемого метода впервые предложена обработка мазков 1% раствором бихромата калия, что способствует повышению проницаемости клеточных мембран, устранению "сшивок" между белками. Бихромат калия является индифферентным веществом, в отличие от фермента трипсина, используемого в этих целях. После воздействия бихромата калия антиген становится более доступным для антител, что является необходимым условием для их взаимодействия. Кроме вышеуказанного бихромат калия подавляет активность эндогенной пероксидазы, устраняя, тем самым, неспецифическую, фоновую окраску. Уменьшение или повышение концентрации бихромата калия от установленных величин не рекомендуется, поскольку в первом случае антиген остается недоступным для антител, а во втором нарушается полнота его выявления.

Одна из сложных проблем - это наличие в сыворотке загрязненных антител. Очистка же сыворотки приводит к снижению ее авидности. Значительное разведение специфической сыворотки также не желательно, так как удлиняет время проведения реакции, может снизится концентрация выявляемого антигена. Для устранения этих недостатков нами предложена обработка мазков 0,3% Тритон Х-100 в течение 15 мин при температуре 37^oС, которая предшествует нанесению первой сыворотки. Используемый детергент адсорбирует загрязненные антитела, в значительной мере устраняя неспецифическое окрашивание. Кроме вышеуказанного Тритон Х-100, как и бихромат калия, повышает проницаемость клеточных мембран, способствуя проникновению используемых антител в клетку. Предложенный впервые новый подход к способу выявления цитокинов и комплекс методических приемов, выполняемых в процессе иммунопероксидазного выявления цитокинов, является обязательным. Невыполнение их не дает объективных результатов или искажает конечный результат исследований, не позволяет провести соответствующую интерпритацию полученных данных.

Предложенный способ осуществляется следующим образом.

1. Клетки крови, полученные путем центрифугирования наносят на предметное стекло (мазок).

2. Высушивают при комнатной температуре.

3. Фиксация в чистом ацетоне - 5 мин.

4. Промывают в фосфатно-солевом буфере (рН 7,2-7,4) в течение 3-4 минут.

5. Обработка в 1% растворе бихромата калия 3-4 минуты.

6. Обработка 0,03% перекиси водорода в течение 20 минут.

7. Промывка в двух порциях фосфатно-солевого буфера (рН=7,2), по 5 минут в каждой.

8. Инкубация в 0,3% Тритон Х-100 при температуре 37^oС в течение 15 минут.

9. Нанесение на мазки моноклональных антител к цитокинам (ФНО, интерлейины). Инкубация с моноклональными антителами при температуре 37^oС в течение 45 минут.

10. Промывка в воде в течение 5 минут.

11. Промывка в двух порциях фосфатно-солевого буфера (рН=7,2), по 5 минут в каждой.

12. Нанесение на мазки антивидовых антител, конъюгированных с пероксидазой. Инкубация в течение 45 мин в темной камере при комнатной температуре.

13. Промывка в двух порциях фосфатно-солевого буфера (рН=7,2), по 5 минут в каждой.

14. Обработка материала в водном растворе, содержащем 0,05% 3,3-диаминобензидин тетрахлорида (ДАБ) и 0,025% перекиси водорода, в течение 3 минут.

15. Слабая докраска гематоксилином.

16. Микроскопия.

Микроскопию окрашенных препаратов проводят в обычном микроскопе. Продукт реакции при исследовании мононуклеаров, содержащих цитокин, выявляется в виде светло- и темно-коричневых гранул внутриклеточно и на клеточной оболочке. При оценке данных микроскопического исследования важно учитывать возникновение артифициальных изменений, имитирующих положительную окраску, Чаще всего это клеточные артефакты, выявляемые по краю мазка. В этом случае необходима оценка реакции на соседних участках.

Необходимые контроли.

Для получения достоверных результатов и исключения возможности неспецифических реакций обязательным условием является проведение контролей на качество реактивов и специфичность антисыворотки.

1) Для проведения контроля специфичности антисыворотки в качестве первого слоя наносят неиммунную сыворотку или буфер (результаты должны быть отрицательными.

2) Неспецифичность сыворотки устраняют посредством максимального разведения высококонцентрированной сыворотки и укорочения времени инкубации.

Описанный способ подкреплен примерами конкретного выполнения.

Было проведено исследование клеток периферической крови 32 детей в острый период гемофильной (вызванной Hemophilus influenzae - b) инфекции, у 10 из них (31,2%) была выявлена экспрессия фактора некроза опухоли и интерлейкина - 6 в мононуклеарах (лимфоциты, моноциты) крови. Все эти 10 детей имели тяжелую клиническую форму гемофильной инфекции. У остальных детей (22 ребенка) заболевание протекало в легкой и среднетяжелой форме, при этом экспрессия цитокинов в данной группе не выявлялась.

В качестве примера приводим микрофотографии лимфоцитов периферической крови с четко определяемой экспрессией фактора некроза опухоли (фото 1) и интерлейкина - 6 (фото 2) больной Бурковой Марии, 2 года 10 мес., N истории болезни 3316 от 13.05,99 г., с гемофильной инфекцией, в острой фазе, тяжелого течения заболевания.

Таким образом, предложенный способ позволяет с высокой степенью специфичности и достоверности выявить экспрессию цитокинов в мононуклеарах крови.

Метод достаточно прост, возможно его широкое применение в практическом здравоохранении для быстрого определения цитокинов в мононуклеарах крови и, соответственно, оценки тяжести течения заболевания и своевременного назначения патогенетической (антицитокиновой) терапии.

Предлагаемый способ имеет экономическую значимость, т.к. при этом не требуется применения дополнительного лабораторного оборудования.

Изобретение относится к медицине, а именно к выявлению экспрессии цитокинов в клетках. Сущностью изобретения является использование иммуноферментной реакции при обработке мазков крови 1% бихроматом калия, 0,03% перекисью водорода, моноклональными антителами к цитокинам 0,3%, Тритоном Х-100, антивидовым коньюгатом и 0,05% водным раствором 3,3 диаминобензидина тетрахлорида. Выявление проводят по наличию окрашенных гранул в мононуклеарах. Техническим результатом является упрощение метода выявления цитокинов, оценки тяжести течения инфекционного заболевания и своевременное назначение патогенетической терапии. 2 ил.

Способ выявления цитокинов путем использования иммуноферментной реакции, отличающийся тем, что берут мазки крови, обрабатывают бихроматом калия 1%, перекисью водорода 0,03%, моноклональными антителами к цитокинам 0,3%, Тритоном Х-100, антивидовым коньюгатом и 0,05% водным раствором 3,3-диаминобензидина тетрахлорида, для промывки на отдельных этапах используют фосфатно-солевой буфер рН 7,2-7,4 и выявление проводят микроскопически, по наличию светло- и темно-коричневых гранул в слабо докрашенных гематоксилином мононуклеарах.