Использование: в генетической инженерии для определения экспрессии, структуры и функции онкогена HRAS1 в нормальных клетках, злокачественных и доброкачественных опухолей человека. Сущность изобретения: плазми- да pHRASTh-З содержит BamH1-BamH1 - фрагмент ДНК рекомбинантного фага Я47,1, кодирующего онкоген HRAS1, карциномы щитовидной железы человека, имеющий точковую мутацию в 12-ом кодоне, промотор фага SP6 и фрагмент полилинкера фага М13, входящего в вектор pSP64. 2 с. п.ф-лы, 3 ил.
Изобретение относится к биотехнологии, в частности, к генетической инженерии и представляет собой конструирование in vitro рекомбинантной плазмидной ДНК pHRASTh- 3, содержащей онкоген HRAS1, выделенный из банка ДНК карциномы щитовидной железы человека, на основе вектора pSP64.
Целью изобретения является создание плазмидной ДНК, пригодной для транскрипции онкогена HRAS1 in vitro, а также получения антиомысловых РНК, определения структуры, экспрессии и функции этого гена в нормальных и опухолевых клетках человека.
Рекомбинантная плазмидная ДНК pHRASTh-З характеризуется следующими признаками:
- имеет размер 9,7 т.п.н.;
- содержит ВатН1-ВатН1-фрагмент ДНК карциномы щитовидной железы человека (без последовательностей ДНК фага) размером 6,7т.п.н., включающий всютранс- крибируемую область онкогена HRAS1 и расположенную в антисмысловой ориентации;
- имеет точковую мутацию (замену G на Т) в 12 кодоне клонированного онкогена HRAS1 (1,704 т.п.н. от ВатН1 сайта в 5-3 направлении);
- содержит ВатН1-ВатН1-фрагмент ДНК вектора pSP64 размером 3,0 т.п.н.;
- несет промотор фага SP6 и полилинкер фага М13;
- имеет уникальные сайты рестрикции;
- несет ген устойчивости к ампицилли- ну.
Способ конструирования рекомбинантной плазмидной ДНК pHRASTh-З заключается в том, что ДН К карциномы щитовидной железы расщепляют рестриктазой ВатН1,
00
ел
ю
XI
со
лигируют с BamH1-плечами вектора бактериофага А47.1 и упакованными вфаг реком- бинантными молекулами ДНК инфицируют клетки Е. coli Q359. С помощью гибридиза- ционного анализа отбирают фаги, содержащие онкоген HRAS1, выделяют его и реклонируют в плазмидном векторе pSP64.
Прототипом полученной рекомбинант- ной плазмидной ДНК pHRASTh-З является плазмида pEJ6.6, содержащая онкоген HRAS1, также несущий мутацию (замена G на Т) в 12 кодоне, клонированный в векторе pBR322. В силу отличий репликативных характеристик векторов pBR322 и pSP64, клони рование в последнем позволяет получать на порядок больший выход плазмидной ДНК pHRASTh-З, по сравнению с pEJ6.6, из одинакового количества биомассы Е. coli. Наличие сильного промотора фага SP6 в плазмиде pHRASTh-З, отсутствующего в pEJ6.6, дает возможность синтезировать антисмысловую HRAS1 РНК, а присутствие полилинкера фага М13 обеспечивает использование более широкого спектра ре- стрикционных эндонуклеаз, чем в случае pEJ6.6, для генетических манипуляций с плазмидной ДНК.
Банк генов ДНК рака щитовидной железы (РЩЖ) человека получали на основе вектора бактериофага Я 47,1 (Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Дж. Молекулярное клонирование, 1984, М. Мир. 477 с.). Высокоочищенную ДНК, выделенную фенол-хлороформным методом, обработанную протеинкиназой К и вновь депроте- инизированную фенолом и хлороформом, гидролизовали рестрикционной эндонукле- азой ВатН1. Разделение фрагментов ДНК РЩЖ проводили в 1 % геле агарозы с последующим выделением зон ДН К в пределах от 4,0 до 10 т.п.н. Присутствие в выделенных зонах последовательностей онкогена HRAS1 тестировали по Southern на нитро- цел л юлозных фильтрах (В А85 Schleicher and Schull, USA) путем гибридизации ДНК со вставкой HRAS1 плазмиды pEJ6.6, меченной 32Р в реакции ник-трансляции,
ДНК фракции N5 РЩЖ, дающей максимальный сигнал гибридизации с газ-специфическими последовательностями, лигировали с Baml-плечами вектора бактериофага Я 47,1 с помощью ДНК-лигазы Е. coli. Упаковку рекомбинантных ДНК проводили с помощью упаковочных экстрактов, полученных из клеток ВНВ 2688 и ВНВ 2690. Скрининг банка рекомбинантных фагов проводили путем гибридизации ДНК из перенесенных бляшек на нитроцеллюлоз- ные фильтры с меченым радиоактивным
зондом HRAS1. Из более 500000 клонов при первичном скрининге выявили 12 положительных сигналов гибридизации с онкогеном HRAS1. Несколько зон, содержащих
рекомбинантные фаги, перекалывали на свежий газон клеток Е. coli Q 359 с последующей экстракцией фагов из бляшек в течение ночи SM-буфером. Рекомбинантный фаг Я 47J-V-25 трижды субклонировали методом конечных разведении, затем наращивали на 10 чашках агарозной культуры Е. coli, штамм Q 359. Бактериофаг экстрагировали SM-буфером в течение ночи, полученный фаголизат очищали и далее выделяли ДНК
биохимическим методом. ДНК фага гидролизовали рестрикционной эндонуклеазой ВатН 1, разделяли электрофорезом в 1 % геле агарозы и получали 3 фрагмента. Два из них (размерами 23,5 и 10,5т.п.н.)соответствовали плечам фага, третий-6,7 т.п.н. содержал последовательности генома человека. После переноса этих фрагментов на нитроцеллюлозные фильтры по Саузерну и последующей гибридизации иммобилизованной ДНК установлено, что с онкогеном HRAS1 гибридизуется фрагмент размером 6,7 т.п.н. После препаративного гидролиза 50 мкг рекомбинантного Я47, фага рестриктазой ВатН1 фрагмент размером
6,7 т.п.н. выделяли из 1 % геля легкоплавкой агарозы.
Полученную ДНКреклонировали в плазмидном векторе pSP64 (Melton D., Kreig P., Rebagliati M. et. al. Efficient in vitro synthesis
of biologically active DNA and RNA hybridization probes from plasmids containing a bacteriophage SP6 promoter. Nuc. Acid Res., 1984, V. 12, P. 7035-7056). Для этого последовательность ДНК HRAS1
размером 6,7 т.п.н. и ДНК вектора pSP64, линеаризованного эндонуклеазой ВатН1, лигировали с помощью ДНК-лигазы Е. coli. Полученной рекомбинантной ДНК трансформировали компетентные клетки Е. coli
НВ 101. Колонии, устойчивые к ампицилли- ну, дающие положительную гибридизацию с pEJ пробой, отбирали, выделяли ДНК и характеризовали ее рестрикционным анализом. На фото.1 представлены результаты
электрофореза, с помощью которого определены размеры плазмиды pHRASTh-З, вставки ДНК онкогена HRAS1 человека (дорожка 2) и вектора pSP64 (дорожка 4). На фото.2 изображена схема рекомбинантной
плазмидной ДНК pHRASTh-З, иллюстрирующая расположение вставки ДНК онкогена HRAS1 человека в векторе pSP64, промотора фага SP6, полилинкера фага М13 и гена устойчивости к ампициллину.
При гидролизе 1-го экзона рестриктазой Msp1 обнаружена мутация в 12-ом кодо- не. С целью определения варианта замены нуклеотидов в 12-ом кодоне была проанализирована первичная последовательность нуклеотидов 1-го экзона онкогена HRAS1 щитовидной железы человека, содержащегося в плазмиде pHRASTh-З. Для этого 1 экзон гена HRAS1 после гидролиза рестриктазой Pst1 выделяли препаративно и клонировали в плазмиде pUC 19. Накопленную плазмиду рВБ1-12 гидролизовали рестрик- тазой EcoR1, разделяли электрофорезом в 6% ПАГ и выделяли фрагмент, имеющий размер 0,37 т.п.н. Для определения первичной структуры проводили мечение по 3 -кон- .цу при помощи фрагмента Кленова и секвенировали по Максаму-Гильберту. На фото 3 представлены результаты определения первичной последовательности нуклеотидов, окружающих 12 кодон, фрагмента плазмиды pHRASTh-З. На радиоавтографе отчетливо видна замена в 12-ом кодоне G на Т.
Пример. Определение первичной структуры 1 экзона онкогена HRAS1 плазмиды pHRASTh-З.
Клонирование фрагмента pHRASTh-З в векторе pUC 19.
С этой целью последовательности 1-го экзона онкогена HRAS1 после расщепления плазмиды pHRASTh-З рестриктазой Pst-1 выделяют препаративно. Фрагмент размером 0,37 т.п.н., представляющий собой 1 экзон онкогена, реклонируют в векторе pUC 19. Около 200 мкг полученной плазмиды рВБ-1, содержащей 1-й экзон онкогена HRAS1, гидролизуют рестриктазой EcoR1 и вектор от вставки отделяют в 6% ПААГ. Фрагмент, имеющий размер 0,37 т.п.н., из ПААГ экстрагируют элюирующим буфером (150 мМ NaCI, 50 мМ Трис-HCI, рН 7,5, 2 мМ ЭДТА) в течение ночи при комнатной температуре, очищают на колонке с ДЕ-АЕ-целлю- лозой и осаждают 2,5 объемами этилового спирта.
Секвенирование 1 экзона онкогена HRAS1 плазмиды pHRASTh-З методом Мак- сама-Гильберта.
ДНК метят по 3 -концу 32Р дАТФ при помощи фрагмента Кленова. 10 мкг меченой ДНК растворяют в 20 мкл Н20 и распределяют по 5 мкл в 4 пробирки, стоящие во льду. В первую пробирку, где проводят химическую реакцию по гуанину, добавляют 14 мкл Н20 и 0,5 мкл 20% диметилсульфата; во вторую - по гуанину и аденину - 14 мкл Н20 и 19 - концентрированной муравьиной кислоты; в третью - по цитозину и тимину - 20 мкл Н20 и 25 мкл гидразина; в четвертую 15
мкл 5М LiCI и 1 М ЭДТА мкл гидразина. Химические реакции продолжаются: в первой пробирке - б, в третьей и четвертой - 8, во второй - 2 мин. Температура реакции во второй пробирке 22°С, а в остальных-10°С. По окончании реакции в каждую пробирку добавляют по 500 мкл 2% LICI04 в ацетоне и два объема этилового спирта. После центрифугирования при 12000 об/мин в течение
0 10 минут осадок растворяют в 500 мкл ацетона, содержащего диметилсульфат. Пробирки встряхивают несколько раз, центрифугируют при 12000 об/мин 80 мин. Осадки промывают 2 раза 80% раствором
5 этилового спирта, добавляют по 50 мкл Ш пипередина, инкубируют 40 мин при 90°С, осаждают 2% раствором LICI04 в ацетоне, промывают ацетоном и 80 % этиловым спиртом. Осадок растворяют в таком количестве
0 буфера нанесения, чтобы в 1 мкл содержалась ДНК с активностью 20000 имп/сек. Разделение нуклеотидов проводили в 8% растворе ПААГ. Радиавтографию гелей проводят в кассетах в стандартных условиях.
5 Полученная карта плазмиды сравнена с картой онкогена HRAS1, выделенного из рака мочевого пузыря человека (Shih С., Weinberg R. Isolation of a transforming sequence from a human bladder carcinoma
0 cell line. Cell, 1982, V. 29, P. 161-169). Оказалось, что клонированная в pHRASTh-З последовательность HRAS1 имеет ту же замену G на Т в 12 кодоне онкогена, что и в гене HRAS1 рака мочевого пузыря.
5 На фиг.1 показан электрофоретический анализ рекомбинантной плазмидной ДНК pHRASTh-З. 1,4-ДНКфага Я, рестрициро- ванныеэндонуклеазами EcoR1 и Hindlll, соответственно; 2 - ДНК pHRASTh-З,
0 рестрицированная зндонуклеазой ВатН1: верхний фрагмент - онкоген HRAS1, нижний фрагмент - вектор pSP64; 3 - вектор pSP64; на фиг.2 - схема плазмидной ДНК pHRASTh-З с рестрикционной и генетиче5 ской картами.
Плазмида pHRASTh-З содержит вставку онкогена HRAS1 карциномы щитовидной железы человека (незаштрихованная область), в которой цифрами HV обозначены
0 экзоны онкогена и указано положение области вариабелных тандемных повторов (ВТП), полилинкер фага М13 (заштрихованные области), промотор фага SP6 (темная область), ген устойчивости к ампициллину
5 (светлая область) с указанием в нем сайтов узнавания различных рестриктаз. На Фиг.З - первичная последовательность нуклеотидов, окружающих 12 кодон фрагмента онкогена HRAS1 в плазмиде pHRASTh-З, полученная по методу Максама и Гилберта
Формула изобретения
ВатН1-ВатН1-фрагмент ДНК карциномы щитовидной железы человека в анти- смысловой ориентации, размером 6,7 т.п.н.;
BamH1-BamH1 - ДНК вектора pSP64, размером 3,0 т.п.н.;
уникальные сайты рестрикции;
Bst 1, Крп 1, Pvk 11, Xho 1, Bam H1,
промотор фага SP 6 и полилинкер фага М13,
генетические маркеры:
ген АР2 - ген устойчивости к ампицил- лину.
1 г. з f
отбирают клоны, гибридизующиеся с онкогеном HRAS1 человека, и выделяют целевую плазмиду.
Заказ 1618Тираж Подписное
ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР 113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., 4/5
