Штамм бактерий BacILLUS тнURINGIеNSIS VaR.кURSтакI для получения инсектицидного препарата против насекомых отряда LерIDортеRа Советский патент 1993 года по МПК A01N63/00 

Изобретение относится к получению средств защиты растений от вредных насекомых, в частности, отряда Lepldoptera и касается нового штамма бактерий Bacillus thuringlensis var. kurstakl для получения инсектицидного препарата.

Цель изобретения - получение нового штамма, имеющего свойства, аналогичные свойствам HD-1, но обладающего более высокой инсектицидной активностью против ряда чешуекрылых паразитов.

Штамм Bacillus thurlnglensls var. kurstakl A20 депонирован в Национальном собрании промышленных и морских бактерий под №МС1 В 12570

Штамм А20 выделен из почвы под кедрами в Кобурге, Онтарио По морфологическим и общим биохимическим свойствам он подобен HD-1, Морфология штамма представлена в табл.1. Для описания морфологии штамма использованы питательный агар Дифко и агаровая основа Bacillus cereus (код СМ617 из Оксоида. Канада)

Биохимические свойства штаммов сравнены в табл. 2-4.

Штамм растет как на органическом, так и неорганическом источнике азота. При использовании неорганического источника азота в среду дополнительно следует внести валин.

С учетом этого сходства оказалось неожиданным, что штамм А20 имеет существенно более высокую инсектицидную

00

ю ел

СА)

О

о

00

активность против ряда чешуекрылых вре- дителей. чем HD- ;.

Хранение штамма.

Штамм А20 может храниться в четырех различных состояниях: суспензия культуры, хранящаяся при - 20°С в глицерине, косой питательный агар при 4°С и суспензия спор, хранящаяся при - 20°С, а для целей долгосрочного хранения культуры - высушенная вымораживанием, хранящаяся при комнат- ной температуре.

Один из путей осуществления способа по данному изобретению состоит в том, что подверженному поражению насекомыми растению придают свойство вырабатывать d-эндатоксин In situ. Это достигается клонированием гена 6-эндотоксина из штамма NC1MB 12570 или 12571 известными способами с использованием подходящего промотора (например, СаМУЗбЗ-промтора), вызывающего экспрессию гена в растениях, и трансформированием растений известными способами (например, с использованием Т-плазмид).

Насекомые, с которыми наиболее эф- фективно можно бороться способом по данному изобретению, являются чешуекрылыми, например такими, которые приведены в табл. 5.

Способ по данному изобретению мож- но использовать для защиты широкого набора растений, подверженных заражению чешуекрылыми. Особыми примерами коммерчески важных растений, защищаемых способом поданному изобретению, являют- ся маис (кукуруза) и хвойные деревья, а также рис, зерновые (пшеница и ячмень) и овощи, включая латук, помидоры и сахарную свеклу.

Изобретение иллюстрируется примера- ми.

Пример 1. Выделение штамма Bacillus thurlngiensls var kurstaki NCIB- 12570(A20).

Образец почвы, взятой под кедрами в Кобурге, Онтарио, разбавили, поместили 0,5 г образца в бутылку, содержащую 45 мл 0,05% пептона. Затем образец термически обработали, для чего его поместили на 10 мин в водяную баню с температурой 60°С. Затем приготовили последовательные разведения, беря по 0,5 мл наиболее разбавленного образца, и помещали его в 4,5 мл 0.05% пептона (например, при помещении 0.5 мл разбавления 1,10 в 4,5 мл пептона получают разбавление 1:100), эту операцию повторили до достижения разбавления 10 . Селект змую среду В. cereus (агаровая основа, Saclilus cereus код СМ617 из Oxold,

Канада) и зскулиновый агар (содержащий, г/л воды, эскулин 1.0: цитрат железа 0,5, пептон 10: NaCI 5; агар 20) засевают суспензиями, разбавленными от 10 до 10 . Засеянные образцы инкубируют при 30°С 5 дней до получения колоний. Отбирают колонии, имеющие темноокрашенные параспораль- ные кристаллы, имеющие форму бипирами- ды. Кристалл - положительные колонии переносят на питательный агар для получения чистых колоний и инкубируют еще 5 дней при 30°С. Колонии проверяют на присутствие кристаллов и чистоту. Очищенные колонии переносят на скошенный питательный агар и хранят в рефрижераторе при 40°С для дальнейшего использования.

Пример 2. Выращивание штамма.

Культуру штамма со скошенного агара засевают в 250 мл колбу Эрленмейера, содержащую 100 мл среды CRL № 1 (содержащую, г или мл/л воды: пептонный бульон 8; глюкозу 6; дрожжевой экстракт 5; ксилозу 0,5:

экстракт муки хлопковых зерен 30 мл; кукурузный экстракт 3,2 мл; солевую смесь Мери Мендель 1 мл). Инкубируют при перемешивании 300 об/мин при 30°С в течение 24 ч. Затем все 100 мл засеяли в 1 л среды указанного состава в 2-х л колбе, инкубировали в течение 5 дней при перемешивании 300 об/мин и 30°С. Ферментационный бульон содержит 10 -109 спор/мл.

Пример 3. Рецептура по данному изобретению.

После завершения ферментации отделили биомассу - споры и кристаллы от ферментационного бульона центрифугированием или микрофильтрацией. Выделенные споры и кристаллы суспендировали в 100 мл воды и получили жидкий концентрат, добавляя 4,9 Morwet D-425 (натриевый наф- талин-формальдегидный конденсат) (диспергирующий агент), 4,9 Veegum HV (алюмосиликат магния) (суспендирующий агент), 4,9 мл Tween 80 (смачивающий агент) и 24,4 мл сорбит (антифриз). Каждый ингредиент добавляют по отдельности в указанном порядке. Продукт хранят при 40°С до использования. Аналогично получили препарат на основе штамма HD-1, который использовали в качестве контроля.

Пример 4. Эффективность ВТ-штам- мов А20 для защиты растений от поражения насекомых.

С использованием описанных в примере 3 рецептур на основе смесей спор и кристаллов, штамма А20. полученных как описано в примере 2, провели испытание на эффективность против гусениц листовертки-почкоеда елового путем опрыскивания листвы. Ветки ели, естественно зараженные насекомыми (личинки в 4-5 возрастной стадии), опрыскали с помощью опрыскивателя модели MRY-2. Для А20 и HD-1 размер капель (диаметр) равен 20-120 мкм при среднем диаметре 32 мкм. Во всех случаях

нанесли около 11 капель на иголку с концентрацией 30 х 109 1 спор/га. Обработанные ветки инкубировали в камере роста до окукливания. Результаты выражены в виде процента смертности, числу мертвых насекомых (число мертвых насекомых + число живых насекомых х 100).

Использование: производство средств защиты растений от вредных насекомых. Сущность изобретения. Штамм бактерий Bacillus thurlnglensls var. kurstakl депонирован в коллекции штаммов Департамента сельского хозяйства США под Nfe C1В12570. Штамм выращивают на среде, содержащей пептонный бульон - 8 мл; глюкозу - 6 г; дрожжевой экстракт - 5 мл; ксилозу - 0,5 г; экстракт муки хлопковых зерен - 30 мл; кукурузный экстракт - 3,2 мл; раствор солевой смеси Мери Мендель - 1 мл. При перемешивании и температуре 30°С полученную биомассу, споры и кристаллы отделяют центрифугированием, суспендируют в 100 мл воды, затем в суспензию вносят последовательно диспергатор 4,9 мл Morwet D-425, суспендирующий агент 4.9 мл veegum HV, смачивающий агент4,9 мл, Тви- на-80 и 24,4 мл антифриза Sorbo. Данный штамм эффективнее известного НД-1 в 5,1 раза. ё

Смертность, деленная на количество препарата (г), использованного в рецептурех

В этом примере с точки зрения коэффициента эффективности А20 является в 5,1 раза более активным, чем HD-1.

Пример 5. Дополнительные испытания на токсичность А20 по отношению к насекомым-вредителям.

-

LCso в мкг сухого вещества на мл корма, соотношение /IKso с /IKso контроля.

Методика определения инсектицидной активности.

В испытаниях используют личинки Trichoplusia nl возрастом 4 дня, которые вскармливают в течение 4 дней при 30°С, используя диету Браусвилля для биоиспытэ- ний, не содержащую антибиотика. Минимум двадцать пять 4-дневных личинок Т. ni подвергают действию препарата в различной дозировке. Личинки выдерживают четыре дня при 30°С и в течение этого времени определяют смертность. Значение эффективной инсектицидной (стандартной) активности получают на основании по меньшей мере трех значений активности, полученных в испытаниях, в которых групповой

Через 5 дней инкубирования по примеру 3 биомассу, споры и кристаллы отделили центрифугированием и осаждали ацетоном. Полученный порошок ввели в искусственный корм, пригодный для испытуемых насекомых. После кормления регистрировали смертность насекомых по стандартной методике. Сравнительные

испытания провели с использованием HD-1.

коэффициент вариации составляет менее 20%. Эти испытания определяются как испытания с минимум пятью точками на кри- оой. где по меньшей мере две точки

находятся выше, а две - ниже ЛКзо, значительной регрессией, значимыми значениями F и на 95% достоверными уровнями значимости в менее, чем ЗХ интервале. Активность штамма NICB-12570 составляет 2000-12000 lv/мг бульона.

Формула изобретения Штамм бактерий Bacillus thuringlensls

var. kurstakl NC1B 12570 для получения ин- сектицидного препарата против насекомых

отряда Lepldoptera.

Примечание. - отрицательная реакция, + положительная реакция, (+) частичная реакция.

Таблица 3 Биохимические маркеры на платах ID-IDENT

Таблица 1

Таблица 2

Примечание,-1- частичное изменение цвета (трудно

идентифицировать) ID-IDENT -- торговое название фирмы Analytas Products

Таблица 4 Биохимические маркеры на платах API-ZYME

При м е ч а н и е. API-ZYME - Торговое название фирмы API ANA TAB PRODUCTS О - реакция отсутствует + - положительная реакция

Продолжение табл. 3

11

Обычное название

Гусеница листовертки-почкоеда елового

Непарный шелкопряд Совка ни Совка хлопковая Походный червь Моль капустная Мотылек кукурузный

1825300

12 Таблица 5

Латинское название

Chorlstoneura fumlferana

Lymantria dlspar Trlchopliisia nl Heliothls Zea Spodoptera exlgua Plutella xylostella Ostrlnla nubllalls