Изобретение относится к области биотехнологии и может быть использовано для диагностики заболеваний растений.
Для получения гибридомы, продуцирующей моноклональные антитела (МКА) к фи- комицетам рода Phytophtora, мышей линии Вз1Ь/с иммунизируют антигенным препаратом мицелия гриба Phytophtora megasperma f. sp. glycinea, затем выделяют иммуноком- петентные клетки селезенки, сливают их с клетками миеломы Sp 2-0-Ag.14, осуществляют скрининг гибридом с помощью иммуноферментного метода и отбирают нужную
гибридому. Гибридные клетки выращивают в культуральной среде или в организме животных, затем культуральную среду или ас- цитную жидкость очищают на колонке с протеин А-сефарозой и выделяют lgG2b,
Штамм Baib Maus/Sp Myelom#PH 4830 получают следующим образом.
Самок мышей линии Batb/c.l в возрасте 4-5 нед. иммунизируют антигенными препаратами мицелия грибов Phytophtora vmegasperma f. sp.glycinea. Первую инъекцию проводят интраперитонеально в объеме 0,2 мл с добавлением адьюванта
00
ы о
4
го
со
Фрейнда, вторую - через 11 мес. аналогичным образом. Спустя 7 дней после последней инъекции животное умерщвляют путем перелома шейного отдела позвоночника. Селезенку удаляют и помещают в 20 мл модифицированной Дульбекко среды Игла (DMEM). Далее селезенку расправляют на стерильном решетчатом сите (80 меш), разрезают, ополаскивают DMEM и затем слегка массируют с помощью одноразового шприца емкостью 10 см3.
Во время экстракции клеток селезенки решетчатое сито постоянно ополаскивают DMEM. Суспензию клеток вносят в одноразовые пробирки для центрифугирования емкостью 50 мл и центрифугируют при 1200 об/мин в течение 10 мин (центрифугирование осуществляют при комнатной температуре).
Надосадочную жидкость отбрасывают, клеточный осадок промывают 10 мл лизиру- ющего эритроциты раствора (0,83 % NH4CI, 0,01 М КНСОз, 0,1 мМоль EDTA) в течение 90 с при комнатной температуре.
Реакцию лизирования останавливают разбавлением раствора с помощью 40 мл DMEM.
Пробу оставляют на 3 мин и затем наса- дочную жидкость пипеткой вносят в 50 мл пробирки для центрифугирования. После центрифугирования осадок клеток промывают 50 мл DMEM и снова центрифугируют. Оставляют небольшую пробу клеток селезенки для подсчета и определения жизнеспособности. Получают 7xf09 клеток селезенки в 5 мл раствора. Клетки миеломы SP2-O-Ag t4 переносят из культуры в стерильные одноразовые полипропиленовые пробирки емкостью 50 мл (7х106 клеток). Затем их центрифугируют в течение 10 мин при комнатной температуре и 1200 об/мин. После центрифугирования надосадочную жидкость помещают в чистый стеклянный стакан, клетки промывают DMEM и снова центрифугируют. В пробирки с промытыми клетками миеломы добавляют клетки селезенки. Затем клетки миеломы и селезенки осторожно с помощью пипетки на 10 мл снова суспендируют и центрифугируют tO мин при 1200 об/мин и комнатной температуре, Надосадочную жидкость отбрасывают. Среду для слияния и ПЭГ 1500 подогревают до 37°С. Ј мл среды для слияния по каплям добавляют в пробирку с ре- суспендированными клетками миеломы и селезенки. В последние 7 мин реакции слияния ПЭГ постепенно разбавляют с по- мощью DMEM. По окончании разбавления общий объем жидкости в пробирке составляет примерно 30 мл.
Во время всей процедуры слияния пробирку слегка перемещают для того, чтобы обеспечить перемешивание находящегося в ней материала.
5Затем пробирку центрифугируют (1200
об/мин, 10 мин при комнатной температуре) и надосадочную жидкость удаляют. В пробирку добавляют 33 мл подогретой ГАТ- среды (ГАТ от гуанин, аминоптерин, тими- 0 дин) и снова ресуспендируют клеточное содержимое с помощью пипетки емкостью 10 мл. Клетки распределяют в 9б-луночных панелях для микротитрования. В каждую лунку вносят 150 мкл суспензии клеток. За- 5 тем лунки заполняют ГАТ-средой. Панели для микротитрования инкубируют во влажной атмосфере 7%-ного СОа при температуре 37°С. Затем клетки в течение 4 дней выращивают в свежей ГАТ-среде сяедующе:- 0 го состава:
DMEM766 мл
L-глутамат10 мл
пенициллин или
стрептомицин (10 000 5 единиц) 100 мл ГАТ10 мл
аминоптерин (2x10-5М
раствор)4 мл
гипоксантин/
тимидин10 мл
0 1 н. NaOH тимидин38,8мг
гипоксантин136,1 мг
в 100 мл стерильной
воды эмбриональная
сыворотка крупного 5 рогатого скота200 мл.
Первые клоны гибридных клеток начинают появляться спустя 7-10 дней. Скрининг гибридом осуществляют следующим образом. 20 мкл содержащего глутаровый 0 альдегид буфера помещают в каждую лунку культуральной панели и инкубируют 3 ч при 55°С/
Панель охлаждают до комнатной температуры и оставшийся буфер отбрасывают. 5 Панели промывают 4 раза дистиллированной водой. 200 мкл антигена, разбавленного в PBS, рН 7,2 (концентрация антигена 10 мкг/мл) распределяют по отдельным лункам и инкубируют 24 ч при 4°С. Оставшийся 0 раствор отбрасывают, панели промывают 8 раз с помощью PBS. Затем в каждую лунку вносят 200 мкл раствора моноэтаноламина и инкубируют следующие 20 ч при 4°С.
Оставшийся раствор отбрасывают, а па- 5 нели 8 раз промывают с помощью PBS. 100 мкл над осадочной жидкости гибридомы, содержащий антитела, помещают в каждую лунку и инкубируют 2 ч при 33°С и высокой влажности воздуха. Оставшийся раствор отбрасывают, а панели 8 раз промывают PBS.
Затем в каждую лунку добавляют 100 мкл биотинированного коньюгата, содержащего tg козы к антителам мыши и стрептови- динпероксидазу. Инкубируют при 37°С и высокой влажности воздуха в течение 0,5 ч, далее раствор отбрасывают и панели 8 раз промывают PBS.
Надосадочный раствор сливают и панель промывают 8 раз с помощью PBS. В каждую лунку помещают 200 мкл субстрата ортофенилендиамина и инкубируют в течение 0,5 ч при комнатной температуре. Затем определяют абсорбционную емкость в красной области спектра при 405 нм. Показатель менее 0,2 считают отрицательной реакцией. Результаты исследований свидетельствуют о том, что полученные гибридные клетки продуцируют МКА к антигенам фикомицетов рода Phytophtora. особенно к Р. megasperma f. sp. medicaginls, P. capsici, P. megasperma f. sp. glucinea. P. citricola и Р. megasperma. Штамм, продуцирующий антитела необходимой специфичности, выводят в массовую культуру и обозначают как Balb Maus/Sp2 Myelom PH 4830. Клонирование и субклонирование штамма осуществляют методом лимитирующих разведений. Штамм характеризуется следующими признаками.
Культуральные признаки. Для выращивания гибридомы используют среду DMEM с добавлением эмбриональной телячьей сыворотки, L-глутамина, антибиотиков, тими- дина, гипоксантина, 125 мл среды наливают в культуральный флакон объемом 750 мл, вносят 10x108 клеток гибридомы и инкубируют в горизонтальном положении в атмосфере 6%-ного С02 при 37°С. Среда истощается через 10-14 дней. Для получения МКА в виде асцитной жидкости самок мышей линии Balb/c возраст от 6 до 8 недель внутрибрюшинно иммунизируют клетками гибридомы (O.SxIO6), которые ресуспендируют в 0,5 мл среды DMEM. За две недели до этого мышам вводят 0,5 мл пристана. Асцит образуется втечение 10-14 дней. Затем животным дают наркоз и в результате пункции отбирают 3 мл асцитной жидкости. Общее количество асцитной жидкости, которое можно собрать от каждого животного составляет 5-6 мл. Продуктивность штамма. Концентрация МКА в асцитной жидкости составляет 3 мкг/мл, в культуральной - 16 мкг/мл.
Характеристика полезного продукта. МКА относятся к подклассу lgG2b. Аффинность МКА составляет 4,3 мкг/мл антигена при 50% максимального значения оптической плотности. Антитела специфически реагируют с антигенами фикомицетов P.megasperma f. sp. medicaglnis.
Использование изобретения иллюстрируется следующими примерами.
П ример 1. Самок мышей линии Balb/c
возрастом от 6 до 8 недель подготавливают внутрибрюшинной инъекцией 0,5 мл пристана для последующей инъекции клеток гибридомы. Затем чеоез 2 нед. животным
0 вводят 0,5x10 клеток гибридомы в 0,5 мл ДМЕМ. Через 10-14 дней животным дают наркоз и собирают асцитную жидкость. Антитела класса lgG2b получают путем хроматографии на протеин А-сефарозе при
5 следующих параметрах:
1.Протеин А/сефароза (6,0 мл)
2.Трис/HCI уравновешивающе-связы- вающий буфер, рН 8.6.
3.Ацетатный отмывающий буфер, рН 0 4,3
4.Глицин/HCI рёгенерационный буфер, рН2.3.
5.Скорость прохождения через колонку - 1 мл/мин.
5 6. Загрузка колонки - 2,5 мл неочищенной асцитной жидкости.
Асцитную жидкость пропускают через колонку и элюируют фракцию tgG2b при рН 4,3. Активность полученных антител опреде0 ляют иммуноферментным методом.
П р и м е р 2. Выделенные из асцитной жидкости МКА конъюгируютс пероксидазой хрена и используют для выявления антигенов P. megasperma f. sp. medicaginls в тка5 нях растений сои. Для этого пробы выращиваемых в грунте соевых растений как с симптомами, так и без симптомов корневой и стеблевой гнили, эстрагируют и испытывают иммунологическим путем в
0 реакции с конъюгатом МКА-пероксидаза хрена, как описано выше.
Результаты исследований представлены в таблице.
Результаты, приведенные в таблице,
5 свидетельствуют о том, что полученный штамм Balb Maus/SP2 MyelomtfpH 4830 продуцирует МКА, специфически реагирующие с антигенами Phytophtora megasperma f. sp. medicaglnls. Такие антитела могут быть эф0 фективно использованы для быстрой диагностики заболеваний растений и распознавания скрытых видов патогенных фикомицетов в растениях.
Формула изобретения
5 1. Способ получения гибридомы, продуцирующей моноклональные антитела к фи- комицетам рода Phytophtora, заключающийся в том, что мышей линии Balb/c иммунизируют экстрактом мицелия Phytophtora megasperma f. sp, glyclnea, выделяют иммунекомпетентные клетки селезенки, сливают их с клетками миеломы, проводят скрининг, отбирают гйбридрму ATGC НВ 9353 и при необходимости ее клонируют и реклонируют.
1. Штамм гибридных культивируемых клеток Mus muscufus L. АТСС НВ 9353, используемый для получения моноклональ- ных антител к фикомицетам рода Phytophtora.
3. Способ получения моноклинальных антител к фикомицетам рода Phytophtora, заключающийся в том, что гибридому АТСС НВ 9353 выращивают в культуре или в живом организме, а моноклональные антитела, относящиеся к. подклассу lgG2b, выделяют из культуральной или асцитной жидкости путем хроматографической очистки.
Использование: сельскохозяйственная биотехнология, диагностика заболеваний растений. Сущность изобретения: получают гибридный штамм Balb Maus/Sp2 Myelom # РН 4830, продуцирующий моноклональные антитела (МКА) к антигенам фикомицетов Phytophtora megasperma f.sp. medlcagmls. Самок мышей линии Balb/c.1 в возрасте 4-5 нед. иммунизируют антигенными препаратами мицелия P. megasperma f. sp. megicaginis, иммунные спленоциты сливают с клетками миеломы 2-0 Ад 14 и отбирают необходимую гибридому путем иммуноферментного анализа. Клонирование гибридомы осуществляют методом лимитирующих разведений. МКА относятся к подклассу lgC2b. Их выделяют из культу- ральной и асцитной жидкости на хроматог- рафической колонке с протеин А-сефарозой. Концентрация МКА в асцитной жидкости составляет 3 мкг/мл, в культуральной 16 мг/мл, 3 с. п. ф-лы, 1 табл. In
