Способ конструирования плазмидного вектора рНС314 или рНС312, или рНС624 Советский патент 1988 года по МПК C12N15/00 

CN

15

20

25

114А3806

Изобретение относится к биотехнологии, генной инженерии, а более конкретно к способу получения плаз- мидных векторов.

Цель изобретения - конструирование плазмидных векторов на основе pBR322, которые обладают большим числом копий на клетку нежели извес .- ные и широко используемые векторы, Q

Плазмидные векторы рНС314, рНС312 И рНСб24 обладают большим числом копий за счет того, что в гене, ответственном за продуцирование реп- рессора плазмидной репликации, лучена мутация.

Пример. Плазмйдную рНС1 расщепляют рестрикционными эндонук™ леазами EcoR1 и Pru 11, а затем од нотяжевые концы дополняют субфрагментом Кленова фермента ДЖ полиме- разы I в присутствии dTP субстратов, У полученных таким образом молекул ДНК с тупьпми концами восстанавливают кольцевую структуру ДНК ли- газой ТА и трансформируют, в НВ101 клетки. Из колоний, растущих на содержащей ампициллин среде, вьщеляют плазмидную ДНК и ДНК-образцы, которые анализируют с помощью агарозного и полиакриламидного гельэлектрофо- реза после переваривания с рестрикционными эндонуклеазамиЕсоК1 , PVU 1.1 и BspPI. На основании полного молекулярного веса плазмиды (2,3 kb) и размера фрагментов, полученных при расщеплении BspP1 (587; 457,- 434j 267; 240j 80 bp) устанавливают, что плазмида рНС81 содержит участок между нуклеотидами 2069 и 2 плазмиды Q рВЮ22 с мутацией, ответственной за высокое число копий.

Вьщеляют фрагмент ДНК размером 1030 вр, полученный расщеплением . рНС81 рестрикционными эндонуклеазами Pst1 и Tag 1, фрагмент ДНК размером 780 вр, полученный расщеплением pBR322 ферментами Pst и С1а1, и фрагмент ДНК размером 218 вр. полученный расщеплением pBR329 ферментом Tag. 1 . Три полученных .фрагмента ДНК смешивают в эквийолярном соотношении, сшивают ДНК лигазой, а клетки НВ101 трансформируют лигатом. Из отдельных слонов, выращенных на содержащей ампициллин среде, выделяют плазмидную ДНК. Эти плазмиды обладает фенотипом большого числа копий. Рас- : щепляя плазмидные ДНК рестрикционны30

35

50

55

е

ю л с и э н а

тя п

5

0

5

Q

Q

0

5

0

5

ми эндонуклеазами, устанавливают, что они были получены путем связывания трех хорошо различных фрагментов различного происхождения. В этих плазмидах проксимальная часть. /з - лактамазного гена была получена из pBR322, участок ответственный за репликацию - из плазмиды pBR322, а фрагмент, выделенный из pHCBI, содержал кроме дистальной части - лактамазного гена также мутацию, приводящую к высокому числу копий. Следовательно, мутация образовыва- ется между нуклеотидами-2573 (tagi) и 3612 (Pst1) ДНК плазмиды pBR322. Опеределяют нуклеотидную последовательность этого участка и сравнивают с известной последовательностью pBR322. В результате этого сравнения устанавливают замену в положении 4074 гена.

Как результат образовавшейся точечной мутации окончание транскрипции репрессорной РНК нарушается и происходит синтез РНК большего молекулярного веса, которая уже не может более функционировать как реп- рессор репликации. Окончание репрессорной функхщи приводит к большому числу копий. За счет этой спонтанной точечной мутации число копий плазмиды в клетке можно повысить в 20-30 раз (примерно 1000) по отношению к исходному значению. За счет этой точечной,мутации число копий любой плазмиды с тем же участком репликации, что и pBR322, можно существенно увеличить.

E.coli НВ101 клетки трансформируют плазмидой . Выделяют плазми- ду ДНК и анализируют с помощью гель- электрофореза после расщепления EcoRI и Psti рестрикционными эндонуклеазами. Для дальнейших исследований отбирают плазмиду, которую можно расщепить на фрагменты 2300 и 110 вр с помощью EcoRl и на фрагменты 1580 и 820 вр с.помощью Psti (рНС314). Плазмиду расщепляют рестрикционной эндонуклеазой Baralll и полученную линейную молекулу частично расщепляют ферментом Hinf1, Фрагменты ДНК размером 2010. вр вьщеляют в 1,2%-ном агарозном геле.

Концы молекульц содержащей одно- тяжевые участки, полученные при расщеплении ферментами BamHl и Hinfl, превращают в тупые концы субфрагмен31443806

том Клеиова с помощью ДНК полиме- разы 1,а затем рециркуляризируют Т индуцированной полинуклеотидной лигазой. Легированные ДНК трансформируют в клетки ИВ 101 и выделяют единичные колонии. Получают плазмиду рНС312, которую нельзя расщепить эндонуклеазой ВатН1, но можно линеарадиоактивности в вьщелейных плазмид- ных ДНК и в хромосомных ДНК. Этим способом число копий плазмид одинакового размера с рНС314 (МБ 1,6 к 10 д) составляло около 1000 на клетку (мол. вес хромосомы 2-10 д) От 60 до 65% полного содержания ДР1К клетки составляет плазмвдная ДНК.

Изобретение относится к биотехнологии, генной инженерии, а более конкретно к способу получения плаз- мидных векторов. Целью изобретения является конструирование плазмидных векторов на основе pBR322, которые обладают большим числом копий на клетку, чем известные и широко не- . пользуемые векторы. Плазмидные векторы рНС314, рНС312 и рНС624 обладают большим числом копий за. счет того, что в гене, ответственном за продуцирование репрессора плазмидной репликации, получена мутация типа замены в положении 3074 участ|):а гена. (У)

ризировать EcoRI и получить фрагменты д Для мечения ДНК in vivo клетки,

1495 вр и Ь1Ь вр после расщепления Hinf1, Для получения вектора с большим числом копий подходящего для клонирования ДНК фрагментов с тупыми концами, плазмиду рНС312 расщепляют рестрикционными эндонуклеазами EcoR1 и Ilinflll, а затем из агарозно- го геля выделяют фрагмент 1980 вр. Этот фрагмент смешивают с ДНК плаз- миды IIAN7, расщепленной ферментами 20 EcoRI и Hinf111, и связывают молекулы полинуклеотидной лигазой. Клетки E.coli НВ101 трансформируют легированной плазмидой и из единичных бактериальных колоний, устойчивых к Amp, вьщеляют плазмидную ДНК. Плаз- мидная ДНК, полученная таким образом (РНС624), не имеет С1а1 сайта, но в отличие от плазмидной рНСЗ12 ее можно разрезать рестрикционными эндонуклеазами Smal, Sail и БатН1.

Пример 2. Для определения относительного числа копий рНС плазмид выращивают E.coli НВ101 культуры, содержащие плазмиды различных разме- ров, полученные из рекомбинантных pBR322 и производных с большим числом копий того ж ё размера до достижения идентичной плотности клеток. Из

содержащие плазмиды, культивируют на М9 культуральной среде, дополн ной следующими компонентами: 0,5% казаминовой кислоты (Difco); 0,5%

15 ГЛЮКОЗЫ} 1 мкг/мл витамина В,; 2 ммоль MgS04, 2 мкг/мл тимидина 250 мкг/мл аденозина и 0,4 MBg/мл (Н-тимидина) 888 Bg/молъ (Хемапол Прага).

Клетки, содержащие плазмиды, ра щепляют . Хромосомные и плазмидные ДНК отделяют друг от друга градие ным центрифугированием с этидиум- бромцц(цезий)хлоридом в равновесно

25 плотности клеточного лизата, полу ченного из бактериальной суспензи выросшей на 2 мл/ОД 5о 4-5 (45000 об/мин, 40 ч, ).

Плазмидные векторы рНС312, рНС3

30 и рНСб24 07.03.84 г. депонированы в Национальной Коллекции Микроорга низмов (OKI, Венгрия) под кодом № 00279, 00280 и 00281 соответстве но.

Формула изобретени

Способ конструирования плазмид ного вектора рНС314 или рНС312,

идентичных количеств полученных сус- -jo или рНС624, заключающийся в том, что

пензий без амплификации выделяют плазмрщную ДНК. Образцы, взятые из препаратов ДНК, подвергают электро- форетической обработке на агарозном геле в 5-, 10-, 15-, 20-, 25-, 30-, 40- и 50-кратном разбавлении соответственно. Плазмиды с большим количеством копий и их пары с нормальным числом копий (того же молекулярного веса) исследуют одновременно. Ре- gQ МИДУ pHCBI, которая содержит точечную мутацию G Т в положении 3074 участка гена, кодирующего репрессор- ную ДНК, далее ДНК плазмиды рН081 обрабатывают эндонуклеазой EcoRI, gg дефосфорилируют щелочной фосфатазой и сшивают с EcoRI фрагментом плазмн- ды nVX, полученной рекомбинантной ДНК трансформируют щтамм E.coli НВ101, отбирают amp колонии, из них

зультаты экспериментов показьтают, что число копий рНС плазмид в 20 - 30 раз больше, чем число соответствующих pHBR322 производных с нор« мальным числом копий.

Пример 3. Абсолютное число копий рНС плазмид определяют путем мечения ДНК клеток, содержащих плазмиды in vivo и измерения отношения

содержащие плазмиды, культивируют на М9 культуральной среде, дополненной следующими компонентами: 0,5% казаминовой кислоты (Difco); 0,5%

ГЛЮКОЗЫ} 1 мкг/мл витамина В,; 2 ммоль MgS04, 2 мкг/мл тимидина 250 мкг/мл аденозина и 0,4 MBg/мл (Н-тимидина) 888 Bg/молъ (Хемапол, Прага).

Клетки, содержащие плазмиды, расщепляют . Хромосомные и плазмидные ДНК отделяют друг от друга градиентным центрифугированием с этидиум- бромцц(цезий)хлоридом в равновесной

плотности клеточного лизата, полученного из бактериальной суспензии, выросшей на 2 мл/ОД 5о 4-5 (45000 об/мин, 40 ч, ).

Плазмидные векторы рНС312, рНС314

и рНСб24 07.03.84 г. депонированы в Национальной Коллекции Микроорганизмов (OKI, Венгрия) под кодом № 00279, 00280 и 00281 соответственно.

Формула изобретения

Способ конструирования плазмид- ного вектора рНС314 или рНС312,

плазмидную ДНК рНС1 расщепляют рет- рикционными эндонуклеазами EcoRI и PruII, затупляют концы с помощью субфрагмента Кленова ДНК полимера- 45 зы I в присутствии dNTP, восстанавливают кольцевую структуру ДНК с помощью ДНК лигазы Т и трансформи- руют штамм бактерий Escherichia coli° НВ101, из amp клонов выделяют плазвыделяют плазмидную ДНК, расщепляют E.coRI и PstI эндонуклеазами и отбирают рНС314, которая может быть расщеплена на фрагменты размерам 2300 и 100 kb к на PstI фрагменты ра.змером 1580 и 820 kb, далее рекомбинантную пйазмвдную ДНК рСН314 в случае конструирования рНС312 расщепляют Ват HI эндонуклеазой, полученную линейную ДНК частично гидролизуют Hinfl эндонуклеазой, выделяют фрагмент размером 2010 kb, восстанавливают кольцевую структуру ДНК, трансформируют штамм E.coli НВ101 данной ре комбинантной ДНК и отбирак)Т рекомбинантную плазмидную ДНК рНС312, со

держащую E.coRI и Hinfl сайты рестрикции и образующую фрагменты размером 1495 и 516 kb после расщепления эндонуклеазами E.coRI и Hinfl плазмиду рНС312,, в случае конструирования рНС624 расщепляют E.coRI и Hind111 эндонуклеазами и выделяют фрагмент 1980 kb, смешивают с расщепленной ферментами E.coRI и Hindlll ДНК плазмиды ПАЫ, фрагменты сшивают ДНК лигазой Тф, трансформируют штамм бактерий E.coli НВ101, полученной плазмидой и из агар клонов отбирают рекомбинантную плазмидную ДНК рНСб24, содержащую Sraal, Sail и BamHI сайты.