СПОСОБ ВЫДЕЛЕНИЯ СТЕРОИДНЫХ ВЕЩЕСТВ ИЗ КУЛБТУРАЛБНЫХ ЖИДКОСТЕЙ Советский патент 1967 года по МПК C07J5/00 C07J1/00 

Изобретение касается способов выделения стеропдных веществ из культуральных жидкостей.

Известные способы выделения стероидных веш.еств из культуральных жидкостей, основапные, как правило, на использовании многократной экстракции органическими растворителями (хлористый метилен, хлороформ, дихлорэтан, этилацетат) с последующихм упариванием и перекристаллизацией, весьма сложпы и не позволяют получать стероиды достаточно высокого качества с удовлетворительным выходом.

Сущность настоящего изобретения заключается в том, что исходную культуральную жидкость пропускают через сильно набухающий катиоппт, например СБС-2 и СБС-3, с последующей десорбцией стероидов органическим растворителем.

Для регенерации катионита обычно используют 10%-ный раствор соляной кислоты.

Пример 1. Пред Н изо л он. В адсорбционную колонку диаметром 97 мм помещают 2300 мл катионита СБС-2 в водородной форме в набухшем виде. Поскольку в исходной культуральной жидкости наряду с растворенным нреднизолоном содержится и кристаллический стероид, а также взвесь белковых веществ, ее предварительно пропускают через нутч-фильтр, на дно которого номещают небольшой слой (50 г) катионита СБС-2. Отфильтрованную лсидкость (70 л) пропускают через адсорбционную колонку со скоростью 240 мл/мин, фильтрат сливают в дренаж. Десорбцию производят пропусканием 10- 11 л технического водного (82%) изопропилового спирта со скоростью 80 мл/мин. Элюат пропускают через нутч-фильтр для растворе ния кристаллического стероида и десорбции его с катионнта. Полученный раствор фильтруют через 20 г активированного угля и упаривают в вакууме. После отгонки спнрта водный раствор охлаждают до , отфпльтровывают выпавшие кристаллы и получают 48 г предннзолона с т. пл. 228,5-230 С. Из :Маточпого раствора дополпительпо получить 9 г продукта. Общий выход 57 г, что составляет 81% от теоретического 1колпчества, считая на исходпый гидрокортизон.

Пример 2. А 1,4-а Н д р ост а д пен д и он3,17. В адсорбционную колонку диаметром 42 мм помещают 600 мл катнонита СБС-2 в натриевой форме в набухшем виде. Культуральную жидкость, отфильтрованную через нутч-фнльтр, как это было описано в примере 1, пропускают через адсорбционную колонку сверху вниз со скоростью 50 мл/лшн, сливая фильтрат в дренаж. Всего нропускают 11,7 л культуральпой л идкости, полученной в процессе микробиологического превращепия 12 г

прогестерона. Десорбцию осуществляют пропусканием технического водного (60%) изопропилового спирта со скоростью 30 мл/мин. Элюат пропускают через нутч-фильтр для растворения кристаллического стероида и десорбции его с катионита. Полученный раствор в течение 1 час перемешивают с 5 г активироБанного угля, фильтруют и упаривают в вакууме. Водный раствор после отгонки спирта охлаждают до 2°С, отфильтровывают вынавший осадок н промывают фильтрат 0,5 л дихлорэтана, в котором затем растворяют полученные Кристаллы. Дихлорэтановый раствор дважды промывают (по 200 мл 1%-ным едким натрием и затем водой до нейтральной реакции) и унаривают в вакууме досуха. Остаток растирают с 16 мл серного эфира, охлаждают, отфильтровывают выпавшие кристаллы, три раза нромывают (но 5 мл) охлажденным серным эфиром и сушат в вакууме при 50°С. Получают 8,48 г Д 1,4-андростадиендиона с т. пл. 138-139,5°С. Выход 78,15% от теоретического количества, считая на исходный нрогестерон.

Пример 3. П р е д н и 3 о н. Очищенную с помощью центрифуги (20000 об/мин) культуральную жидкость в количестве 11,8 .л подкисляют соляной кислотой до рН 3 и пропускают через адсорбционную колонку, описанную в примере 2, со скоростью 60 мл/мин. Десорбцию осуществляют техническим водным (60%) изопропиловым спиртом со скоростью 30 мл/мин. Элюат (3 л) в течение 1 час перемешивают с 5 г активированного угля, фильтруют и отгоняют спирт в вакууме. Выпавшие кристаллы отфильтровывают, тщательно перемещивают с 10 мл охлажденного 40%-ного водного изопропилового спирта, снова отфильтровывают и сушат в вакуум-сущильном шкафу. Получают 2,89 г лреднизона, что составляет 72% от теоретического количества, считая на исходный ацетат 1кортизона, взятый в количестве 4,5 г.

Пример 4. Д и а н а б о л. Через адсорбционную колонку, заполненную 600 мл катионита СБС-2 в Н-|фОр ме, сверху вниз со скоростью 100 мл/мин пропускают 14,64 л культуральной жидкости, полученной в нроцессе ферментационного дегидрирования 3 г метилтестостерона. Десорбцию осуществляют снизу вверх пропусканием 70%-ного водного изопропилового спирта со скоростью 30 мл/мин. Элюат (2 л) на холоду обрабатывают 5 г активированного угля и упаривают в вакууме до появления кристаллов. После охлаждения осадок дианабола отфильтровывают, а маточный раствор упаривают в вакууме при температуре не выше 50°С до объема 180-200 мл. После охлаждения вновь отфильтровывают кристаллы стероида, а фильтрат дважды промывают (ПО 100 мл) горячим четыреххлористым углеродом, в котором затем растворяют полученный из маточного раствора осадок. К раствору добавляют 0,5 г активированного угля, кипятят 15 мин, отфильтровывают уголь и нромывают его горячим растворителем. Раствор упаривают до объема 20 мл и оставляют при комнатной температуре «а сутки. Выпавший диалабол отфильтровывают, промывают охлажденным четыреххлористым углеродом я сушат в вакуум-сушильном шкафу при 50°С. Получают 2,48 г (83,5% от теоретического количества, считая на исходный метилтестостерон) дианабола с т. нл. 163-164°С.

Прнмер 5. Вещество ЭПИ-F. 11 л культуральной жидкости, содержащей 0,042%

вещества ЭПИ-F и имеющей рП 5,34, пропускают через 4 колонки, в каждую из которых загружено по 15 г катио«ита СБС-3 в Н-форме, со скоростью 1,4 мл/мин на 1 cм. Десорбцию осуществляют нропусканием 770 мл водного (82%) изопропилового спирта с той же скоростью. Из полученного элюата отгоняют спирт и получают 3,4 г (92% от теоретического количества) вещества ЭПИ-Р.

Прнмер 6. Гидрокортизон. 13,4 г культуральной жидкости, содержащей смесь гидрокортизона и вещества ЭПИ-F, пропускают через колонку с 900 мл смолы СБС-2 со скоростью 3,3 мл/мин на 1 Суцг. Десорбцию

осуществляют Пропусканием нагретого до 55°С технического водного (76%) изонропилового спирта со скоростью 1,6 мл/мин на 1 ел. Водно-спиртовой элюат (4 л) фильтруют через 10 г активированного угля, который затем

промывают -горячим изопропиловым спиртом (3 раза по 25 мл). После упаривания в вакууме при 50°С отфильтровывают выпавшие кристаллы, добавляют к фильтрату хлороформ и вновь выпавшие кристаллы объединяют с

основным веществом. Получают 3,88 г смеси гндрокортнзона с веществом ЭПИ-F. Эту смесь растворяют при нагревании с обратным холодильником в 150 мл метанола, добавляют активированный уголь, кипятят 20 мин, фильтруют, промывая уголь кипящим метанолом (3 раза по 15 мл) и упаривают в вакууме до 20 мл. После суточной выдержки в холодильнике и дОПолннтельного часового ОХлаждения в охлаждающей Смеси отфильтровывают вынавшнй осадок через бязь, промывая его охлажденным эфиром (2 раза по 15 лгл),ндважды Перекристаллизовывают на метанола (30- 35 мл). Перекристаллизованный гидрокортизон промывают охлажденным эфиром (2 раза по 10-15 мл) и сушат при 60-70°С в суЩнльпом шкафу в течение суток. Получают 1,97 г стероида. Из маточных растворов дополнительно выделяют еще 0,63 г гидрокортизона, таким образом общий выход составляет

2,6 г. 5 что, с целью упрощения процесса, увеличения выхода и повышения качества целевых продуктов, культуральную жидкость пропускают 6 через сильно абухающий катионит, например СБС-2 н СБС-3, с последующей десорбцией стероидов органическим растворителем.