СПОСОБ КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ №-АЦЕТИЛСУЛЬФАНИЛАМИДА И СУЛЬФАНИЛАМИДАВ СМЕСИ Советский патент 1968 года по МПК G01N31/00 G01J3/40 

Способ количественного спектрофотометрического определения Ni-ацетилсульфаииламида и сульфаииламида в смеси относится к области биохимии. Он может быть использован для зучеиия ацетилирования сульфаниламида в изолированных хлороиластах листьев растений. Принции метода может найти применение при ферментативном анализе анетата, ацетил-КоА, а также количественном определении ферментов-ацетил-КоА-синтотазы и ариламин-ацетилтраисферазы.

Предлагаемый способ основан на измереиии оитических плотностей N анетилсульфаииламида и сульфаииламида в средах с различными рН.

По приведенному уравнению кониентрации компонентов смеси определяют по значениям оптических плотностей, полученных при одной и той же длине волны в растворах с рН 0,1-0,5 и 4-10:

Ва

м/л; С,

-Ml л.

:

Ка(Е,К,-Е) ,

Cf. - конС,.

If

АС - Аа

(л 255-7 е -молярный коэффициент поглощения, равный 15400 (л 252-8 ммк); EI - суммарная оптическая плотность данного раствора при иодкисленш до рН 3,5; Е -оптическая плотность Х -апетплсульфаниламида; - суммарная оптическая плотность данного раствора при рН 4-13; К.,, и K,f - отношение оптических илотностей, измеренных ири рН 4-13, в максимуме поглощеиия к оптическим плотностям, liSMCpennbiM при рН-СЗ.5 (257-253).

Через Лд и /( учитывают поправки на уменьшение молярных коэффициентов поглощения с падением рИ среды и поправки на

измерение оитических плотностей (при рМ 3,5) не в максимуме поглощения.

Молярный коэфф1щиент поглощения Л- ацетилсульфаниламида не изменяется в пределах рН 0,1 -13 и уменьшается ниже п вьпие

этих иределов. Молярный коэффициент поглощения сульфаниламида падает при ,0, а ири ,5 он изменяется незначительно. Па основании такого различия свойств Л-iацетилсульфаниламида и сульфаниламида в зависимости от кислотности среды можно вычислить математически концентрацию каждого компонента в смеси без их разделения. Оптическую плотность Е желательно измекак в этих условиях не требуется введение специального поправочного коэффициента на измерение оптической плотности не в максимуме поглощения сульфаниламида. При измерении же величин Е в пределах рН 10-13 поправочный коэффициент следует учитывать.

Чтобы определить концентрацию сульфаниламида и №-ацетилсульфаниламида в смеси по одному измерению в сильнокислой среде в конкретных условиях опыта, строят калибровочный график. Для этого в пробирки вносят по 0,1 мл смеси указанных сульфамидов разной концентрации. Затем добавляют 3,9 мл буферного раствора № 1. Смесь перемешивают, и измеряют оптическую плотность растворов.

Очистка биологической жидкости.

Метод использован для изучения процесса ацетцлирования сульфаниламида в хлоронластах. Прямому спектрофотометрическому определению этих сульфаниламидов в суспензии хлоропластов, содержащей необходимые компонеиты для ацетилирования сульфаниламиды мешают АТФ, АМФ, КоА, белки и другие вещества, имеющие поглощение в УФ-свете. Частичную очистку системы проводят на алюминиевом геле (гидроокиси алюминия), который получают добавлением в инкубационную смесь А12(5О4)з и КОП. Белок осаждают добавлением 5% НС1О4. В ходе опытов устанавливают, что осаждеиие мешающих веществ на алюминиевом геле в значительной степени зависит от рН раствора. При рП 5-6 наблюдают практически полное осаждение АТФ, ЛМФ, КоА. При этом Ni-ацетилсульфаниламид и сульфаниламид обнаруживают в надосадной жидкости.

Ход анализа.

Инкубационная смесь для изучения ацетилирования сульфаниламида в хлоропластах содержит, мкмоль: 150 трис-ПС1-буфер при рП 8,5; 1050 сахарозы; 4 АТФ; 3,0 ацетата калия; 10 MgCU, 0,4 КоА; 1,86 сульфаниламида, а также суспензию хлоропластов (0,4-0,6 мг хлорофила). Общ.ий объем инкубационной смеси 4 мл.

К 4 мл инкубационной смеси в колбе Эрленмейра приливают 2 мл 5%-ной ITClOi и содержимое перемешивают вран1ательным движением колбы. В колбу вносят 1,0 мл 1 МА12(504)з и 5 Н КОН. Предварительно определяют количество вноси.мой щелочи путем титрования специальной пробы, в которую добавляют все указанные выше компоненты смеси, раствором 5 П КОП до рП 5,5. При титровании щелочь приливают к пробе из -мл микробюретки.

Количество вносимой щелочи колеблется в пределах 1,2-1,8 мл. После добавления в исследуемые пробы найденного количества 5 П КОП смесь перемешивают, и цолученную

суспензию центрифугируют 20 мин при 15000 g. К 3 мл надосадочной жидкости добавляют 3 мл 20%-ной ПС1О4.

При этом рП раствора меньше 0,5. Оптическую плотность проб измеряют при длипе

волны 257 ммк. Количество №-ацетилсульфаниламида определяют по калибровочному графику.

Для построения калибровочного графика к 3,8 мл инкубационной смеси добавляют 2 мл

5%-ной ПС1О4, 0,2 мл смеси указанных сульфамидов разной концентрации; 1,0 мл Al2(SO4);i и 5 П. КОН (рП 4,5). Смесь перемешивают, очищают на алюминиевом геле, спектрофотометрируют, как описано выше. Па

оси абсцисс откладывают концентрации N ацетилсульфаниламида и сульфаниламида, а на оси ординат - их оптические плотности.

При проведении определения в условиях, имитирующих ацетилирование сульфаниламида, начальная концентрация которого известна, концентрацию N--ацетилсульфаниламида и сульфаниламида вычисляют по одному измерению оптической плотности при длиие волны 257 ммк при рП 0,1-0,5.

Предмет изобретения

1. Способ количественного определения К-ацетилсульфаниламида и сульфаниламида

в смеси, отличающийся тем, что, с целью повышеиия точности определения, анализируемую смесь обрабатывают хлорной кислотой и смесью сернокислого алюминия и едкого калия, центрифугируют, подкисляют и спектрофотометрируют дважды при одной длине волны в интервале 255-263 ммк при различных рП среды (от -1,8 до -f-3,5 и 4-13) и расчетным путем оиределяют содержание компонентов в смеси.

2. Снособ но п. 1, отличающийся тем, что снектрофотометрируют при 257 ммк и рП 0,1-0,5 и 4,0-10.