СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ВИРУЛЕНТНОСТИ ШТАММОВБРУЦЕЛЛ Советский патент 1968 года по МПК C12Q1/58 

Известные способы определения вирулентности (степени натогенностн) болезнетворных микроорганизмов, нанрнмер бруцелл, не позволяют определять вирулентность микроорганизмов без заражения подопытных животных.

Предложенный способ отличается тем, что с целью быстрого определения вирулентности без использования лабораторных животных вирулентность шгаммов бруцелл определяют путем сравнения активности их ферментов - уреазы и дезаминаз. Активность уреазы определяют при оптимальных условиях на желатиновой среде, содержагцей только один субстрат, ферментируемый бруцеллами, а именно - мочевину. Активность дезаминаз определяют по степени подщелачивания питательной среды, не содержащей мочевнну.

По предложенному способу вирулентность бруцелл определяют не на животных, а на основании биохимических свойств бруцелл, т. е. по способности бруцелл образовывать аммиа-к при гидролитическом расщеплении мочевины под действием уреазы и дезаминировании аминокислот питательной среды под действием дезаминаз.

Перед определением активности дезаминаз и уреазы -культуры исследуемых щтаммов необходимо проверить на диссоциацию по реакции термопреципитации и агглютинации е трипафлавином. При обнаружении признаков диссоциации необходимо произвести рассев и проводить дальнейщую работу с культурами, находящимися только в S- или в R-форме, но не в смешанной (SR). 5

Определение дезаминазной активности у бруцелл

Принцип метода основан на изменении в

0 щелочную сторону рН среды в процессе роста культур бруцелл, наблюдаемом под контролем фенолового красного индикатор-а. Чтобы избежать подщелачивания за счет мочевины в мясной воде и .поченочном экстракте, последние выдерживают 15-20 час с кристаллической уреазой.

Приготовление среды. Отмеривают 1 л мясной воды (1:2); 0,3 л печеночного экстракта (1:1), приготовленных из мяса и печени молодой говядины, 10 г сухого пептона, 65 г кристаллической уреазы и 13 мг фенолового красного индикатора. Смесь тщательно перемещивают до полного растворения всех ингредиентов и оставляют на час при 5-

5 8°С.- . После выдержки к смеси прибавляют 5 г поваренной соли, и устанавливают рН 7,6-7,8. Затем добавляют 30 г сухого агар-агара, и всю смесь автоклавируют при 1 йглг (120°С)

гоклаве для декантирования. Когда среда остынет, осадок срезают и удаляют.

После растапливания среды текучим паром к ней добавляют 1р/о глюкозы, 2% глицерина и устанавливают рН 7,1-7,2. Затем среду разливают по 5 мл в пробирки с ватными лробками и стерилизуют 30 мин под давлением 0,5-0,7 атм (110-115°С). Пробирки должны быть подобраны одного диаметра и сорта стекла.

Готовая среда в толстом слое должна иметь оранжевый цвет, а в одной пробирке - желтый, с конечной рН 6,8-6,9.

Пробирки со средой скашивают так, чтобы среда покрывала только дно пробирок и оставляют в горизонтальном положении на двоетрое суток при комнатной температуре для подсушивания.

На подсушенные среды производят обильный посев штаммов бруделл. Для этой цели берут полную петлю (Д 2 мм) бактериальной массы бруцелл с двухсуточной агаровой культуры и равномерно распределяют по всей поверхности МППГГА с индикатором. Каждый штамм бруцелл засевают .параллельно на две пробирки. Культуры выращивают в течение двух суток в термостате при 37,5- 38°С во влажной атмосфере (в термостат ставят сосуд с водой). При этом нужно следить, чтобы в помещении не находились летучие кислоты и основания.

Выращенные 48-часовые агаровые культуры бруцелл выдерживают в течение 1-2 час в холодильнике при 5-8°С, после чего производят учет степени подщелачивания среды. У штаммов бруцелл, давших плохой рост на МППГГА с индикатором (менее 6 млрд. микробных тел на 1 мл среды), степень подщелачивания не учитывают, и они вновь пересеваются.

Оценка активности дезаминаз основана на способности каждого штамма бруцелл к максимальному подщелачиванию МППГГА и ведется по пятибалльной системе:

О - нет изменения цвета среды оо сравнению с незасеянной пробиркой;

-1слабо-оранжевый цвет среды;

+ Норанжевый цвет среды;

+ + Нкрасный цвет среды;

+ + +:+; - малиновый цвет среды с фиолетовым оттенком.

Контроли. Для проверки правильности приготовления данной серии среды перед массовым исследованием штаммов бруцелл ставят ее контроль. С этой целью засевают пять штаммов бруцелл на две-три пробирки каждый, обладающих различной активностью дезаминаз и не изменяющих своих свойств при многократных пересевах:

1.Вг, .abortus «Лента (виру-О

3.Вг. abortus 19 (вакцин-+:-f

ный)

4.Вг. melitensis -1 (вакцин- Revный Эльберга)

5.Вг. abortus 544 (эталон- ,++-Ы

ный)

и две пробирки со средой оставляют при тех же условиях не засеянными.

Примечание. При отсутствии в лаборатории названных штаммов можно подобрать штаммы из числа имеющихся с нужной активностью дезаминаз, которая не меняется при многократных иересевах.

Если на данной серии среды контрольные штаммы хорошо растут и получены четкие

контрольные результаты, на нее засевают исследуемые штаммы бруцелл. При этом двухсуточные культуры контрольных штаммов принимают за колориметрические эталоны при оценке активности лезаминаз у исследуемых

штаммов бруцелл. Причем данные колориметрические эталоны относят только к данной серии среды.

Для получения более достоверных результатов активность дезаминаз у всей .нартии

исследуемых штаммов бруцелл следует определять не менее трех раз и на одной серии среды.

Определение уреазной активности у бруцелл

Принцип метода основан на изменении рН среды в процессе гидролиза мочевины под действием уреазы бруцелл .на аммиак и углекислоту. Скорость подщелачивания среды за счет аммиака служит мерой -активности уреазы штаммов бруцелл. Учет скорости подщелачивания среды ведут под контролем фенолового красного индикатора до полного изменения цвета среды от лимонно-желтого до малинового..

Определение активности уреазы у бруцелл производят на жидкой желатиновой среде, содержащей только один ферментируемый бруцеллами субстрат - мочевину.

Приготовление среды. В калбе на кипящей водяной бане в 1 л дистиллированной воды растворяют 20 мг фенолрота и 10 г желатины. После того как вся желатина растворится, колбу ставят непосредственно на огонь, доводят до кипения, затем снимают с огня и плотно закрывают пробкой.

В отдельной колбе из однозамещенного фосфорнокислого калия и двузамещенного фо-сфорнокислого натрия нриготовляют 1/15 М

буфер с рН 6,8.

Для .приготовления 1 л среды к 950 мл раствора желатины с фенолрот (температура комнатная) прибавляют 50 мл 1/15 М фосфатного буфера, доводят до кипения и кипятят на

очень слабом огне 2 мин. После этого колбу снимают с огня и, не давая остыть жидкости, быстро растворяют в ней 20 г мочевины, всыпая последнюю небольшими порциями. Как только вся мочевина растворится, плотно заостужают под краном. По остывании среда готова для работы.

При комнатной температуре готовую среду и раствор желатины с индикатором хранить нельзя. При температуре О + 5°С готовая среда сохраняется до пятнадцати дней, раствор желатины с индикатором-до сорока пяти дней. Признаками непригодности среды служит изменение первоначального цвета индикатора и разжижение желатины.

Необходимое оборудование:

стерильные пилетки на 2 мл. Для каладого штамма бруцелл заготавливается отдельная пипетка;

стерильные пробирки (1,5X15 см) должны быть подобраны одного диаметра и сорта стекла. Особенно тщательно должны быть подобраны пробирки для приготовления одномиллиардных взвесей бруцелл, которыми следует пользоваться во всех последующих анализах;

стерильная бюретка на 50-100 мл.

Ход анализа.

На стерильном физиологическом растворе по бактерийному стандарту мутности для паратифозных бактерий готовят одномиллиардные взвеси штаммов бруцелл и разливают по 1 мл параллельно в две пробирки. Затем во все пробирки добавляют из бюретки по 5 мл желатиновой среды, содержимое пробирок перемешивают и пробирки ставят в термостат при температуре 37,5-38°С. Содержимое пробирок после смешивания взвеси бруцелл сО средой должно быть лимонно-желтого цвета.

Учет реакции ведут в течение первых 3 час с момента смешивания взвеси бруцелл со средой и затем через 24 час выдерживания в термостате.

Оценку уреазной активности производят по пятибалльной системе:

+ + + + - полное изменение цвета среды в течение 1 час.

.-г-Ыполное изменение цвета среды

в течение 2 час.

+ Нполное изменение цвета среды

в течение 3 час.

Н полное изменение цвета среды

более 3 час.

О - нет изменения цвета среды через 3 час и не отличается от контроля через 24 час выдерживания в термостате.

Во избел ание субъективизма в оценке конца реакции готовят колориметрический эталон: в пробирку с 1-2 г хлористого аммония добавляют 0,01 н. раствор едкого натра (калия) с 0,002 г % фенолрота до появления стойкого малинового окрашивания с красным оттенком (раствор едкого натра с индикатором в такой же пробирке и.меет фиолетовый оттенок); 6 мл готового раствора отмеривают в пробирку и запаивают. Цвет приготовленного таким образом эталона очень стоек и не меняется при длительном хранении.

раллельно с определением активности дезаминаз.

Контроли. Прц проведении каждой серии анализов рекомендуется ставить следующие контроли.

Для проверки правильности приготовления среды следует брать эталонные штаммы бруцелл с заведомо известной активностью уреазы: Вг. suis .9 1330, полностью изменяющий цвет среды в среднем за 25 мин. (+ + +.+ ), и Вг. abortus № 544, не обладающий уреазой и не изменяющий цвета среды на протяжении всего срока наблюдения (0).

Для контроля стерильности компонентов к 1 мл физиологического раствора, на котором готовились взвеси бруцелл, добавляют 5 мл среды. При этом в течение 24 час выдерживания в термостате не должно наблюдаться

.покраснения среды.

У высокоактивных штаммов бруцелл активность уреазы может колебаться при повторных определениях в пределах 10 мин, у слабоактивных- в пределах 20 мин.

Определение вирулентности у бруцелл

Величину степени вирулентности штаммов бруцелл определяют по разности между величиной активности уреазы и величиной активности дезаминаз, выраженных в одинаковых условных единицах:

Вирулентность + (уреаза - дезаминазы). Че.м больше разность между активностью уреазы и дезаминаз, тем выше вирулентность штамма бруцелл. При положительной разности между активностью ферментов вирулентность штамма бруцелл зависит от активности уреазы, при отрицательной - от активности дезаминаз.

Пример 1. Например, у эталонного штамма Вг. suis ЛЬ 1330 активность уреазы составляет + , активность дезаминаз +, следовательно его

вирулентность ( + + + + ) - ( + ) -|-|-|-. Пример 2. У вакцинного штамма Вг. abortus N° 19 и активность уреазы и активность дезамнназ составляет , следовательно его вирулентность (-)-|-) - (-|-|-) 0.

Пример 3. У эталонного штамма Вг. abortus ЛЬ 544 активность уреазы составляет О, а активность дезаминаз + + + + , следовательно его

вирулентность (0) - ( + + + +)

-(+ + + + )

Описанный способ позволяет быстро и с достаточной достоверностью определять вирулентность штаммов бруцелл, например, при дифференциации эпизоотических штаммов о г вакцинных, при отборе и подборе вакцинных штаммов, при изучении направленной изменчивости у возбудителя бруцеллезной инфекции 7 Предмет изобретения 1. Способ определения вирулентности штаммов бруцелл, отличающийся тем, что, с целью быстрого определения вирулентности без использования лабораторных животных, вирулентность штаммов бруцелл определяют путем сравнения активности их ферментов - уреазы и дезаминаз. 8 2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что активность уреазы определяют .при оптимальных усло.виях на желатиновой среде, содержащей только один субстрат, ферментируемый бруцеллами, а именно - мочевину, в. Способ по п. 1, огличающийся тем, что активность дезаминаз определяют по степени подщелачивания питательной среды, не содержащей мочевину.