ШТАММ ИНМИ АРМ 647 BACILLUS THURJNGIENSIS VAR. THURINGIENSIS (BERLINER) Советский патент 1970 года по МПК A01N63/00 

Штамм был выделен в Институте микробиологии АП Армянской ССР в процессе изучения возбудителей бактериальных болезней тутового шелкопряда. Источником явилась погибшая куколка тутового шелкопряда в период весенней выкормки из племенной шелкаводческой станции в г. Ереване.

Исходная культура бактерий активно спорулировала с образованием ромбовидных параспориальных включений - энтомоцидных токсинов. В результате дальнейшего культивирования исходной культуры была получена стойкая аспарагиновая раса, лишенная способности образовывать энтомоцидные кристаллы. Однако при этом штамм активно продуцировал другой энтомоцидный токсин, растворимый в культуральной жидкости и обладаюший термостабильностью.

Далее дано описание аспорогенной разновидности, которую можно отнести к Вас. thuringiensis серотипу Berliner.

Вегетативные клетки прямые, палочковидные, (1,2-1,4)Х(3-6 мк). Подвижные, в виде коротких и длинных цепочек. Перитрихи, грамположительны. Споры не образуются, в процессе развития внутри клеток ромбовидные кристалловидные образования не наблюдаются. При цитохимическом изучении (окраска Суданом черным) в клетках обильно выявляются жировые включения.

Па мясо-пептонном агаре образует бе.яовато-серые плоские зернистые колонии с ризоидными краями. Колонии в среду не врастают и легко снимаются петлей. Па мясо-пептонном бульоне обильный рост без образования пленки. Па мясо-пептонном агаре-|-сусло агар-беловато-желтые колонии с бугр-истыми прожилками, влажно-блестяш,ие. Обильный рост.

Па мясо-пептонном агаре с добавлением яичного желтка - обильный рот без пигментации.

Па синтетических средах (СР1-СРП) - умеренный рост с сильно ризоидными краями, беловатые колонии.

Па ломтиках картофеля и моркови - беловато-серый рост, влажно-блестяший. Пигментация ломтиков отсутствует.

Усваивает аммонийный азот, для роста необходи.мо присутствие аминокислот.

Усваивает также глюкозу, фруктозу, рибозу, сахарозу, мальтозу, трегалозу, глицерин, целлобиозу, крахмал, салицин с образованием кислоты без выделения газа. Слабо усваивает арабинозу, рамнозу, ксилозу, галактозу, лактозу, раффинозу, мелибиозу, мелезитозу, талозу, маннит, сорбит, дульцит, инулин, инозит, эритрин. Усваивает нитраты, оксалаМолоко слабо пептонизирует, желатин умеренно разлсижает. Крахмал тидролизует.

Денитрификация сильно положительна. Ацетилметилкарбинол не образует. Индол и сероводорд не образует.

Гемолизины (на среде с кровью человека) слабо выражены, тииа р-гемолизина. Лецитиназу активно образует.

Серологическая типизация с сы1вороткой, полученной к жгутикову (Н) антигену, свидетельствует о принадлежности данного штамма к разновидности Вас. thuringiensis var. thuringiensis (Berliner), серотипу 1 по классификации Бенефуа и Де Бержак (1962,1963).

Антагонистические свойства к другим видам бактерий очень слабо выражены. Подвержен действию лабораторных и производственных фагов.

Факультативный аэроб, оптимум роста при 35-37° С.

Образует термостабильный токсин, вызывающий гибель мух и гусениц тутового шелкопряда.

Проведенные опыты показали, что этот штамм образует энтомоцидный токсин, не разрушающийся при автоклавировании. Токсин продуцируется на многих питательных средах, содержащих источники органического азота и усвояемые углеводороды. Для этого вполне пригодным является мясо-пептонный бульон, а также среда следующего состава, г:

КН2РО4 6,8, MgSO4-7H2O 0,123, MnSO ШаО 0,002, ZnSO4-7H20 0,014, СаСЬ 4НаО 0,183, пепетон 7,5, глюкоза 10,0; вода дистиллированная до 1,0 л.

К этой среде добавлягот 10 мл раствора сульфата аммония из расчета 1 г этой соли на 100 мл .воды с 2 г Fe2 (804)3.

Инкубация культур на указанных средах ведется при 28-30°С в условиях глубинного выращивания. Образование термостабильного энтомоцидного токсина отмечается у культур уже однодневного возраста. Энтомоцидная активность нативной жидкости не теряется после автоклавирования при 120°С в течение 15 мин.

Опыты доказали, что пр;и 1вскармливании комнатной мухи нативным фильтратом (вместе с сахарным сиропом) описываемого штамма наблюдается почти полная гибель мух.

Тутовый шелкопряд ,в стадии гусеницы, вскармливаемый нативным фильтратом штамма, погибает в стадии куколок на 100%. В контрольных вариантах с культурой Вас. thuringiensis var. thuringiensis, которая используется в производстве бактериальных инсектицидов, смертность насекомых была в два-три раза ниже.

Особенности предлагаемого штамма по сравнению с другими штаммами Вас. thuringiensis видны также из табл. 1, 2 и 3,

Предмет изобретения

Штамм ИНМИ Арм 647 Bacillus thuringiensis var. thuringiensis (Berliner).

Зарегистрирован в Институте микробиологии АН Армянской ССР.

Морфология клеток. Клетки прямые, палочковидные размером (1,2-1,4)Х(3-6 мк). Подвижные, встречаются в виде коротких и длинных цепочек Иеритрихи, грамположительны. Споры и ромбовидные включения в клетках не образуются. Окраска судаком черным выявляет внутри клеток жировые включения, многочисленные у молодых форм.

Отношение к кислороду. -Факультативный аэроб. Максимум роста при 35-37°С. Мясо-пептонный агар. Беловато-кремовые плоские зернистые колонии с ризоидными краями. Колонии в среду не врастают и легко снимаются петлей. Пигменты не образуются.

Мясо-пептонный агар- сусло, Балинг 7°. Беловато-желтые колонии с бугристыми прожилками, влажноблестящие. Обильный рост.

Мясо-пептонный агар с яичным желтком. Обильный рост без пигментации.

Мясо-пептонный бульон. Обильный рост, без образования пленки.

Молоко. Слабо пептонизирует с образованием сгустка.

Желатин. Умеренно разжижает.

Крахмал. Гидролизует.

Картофель и морковь. Хорощий беловатосерый рост без пигментации.

Глюкоза, фруктоза, рибоза, сахароза, мальтоза, трегалоза, глицерин, целлобиоза, салицин. Усваивает с образованием кислоты, без выделения газа.

Арабиноза, рамноза, ксилоза, галактоза, лактоза, раффиноза, мелибиоза, мелезитоза, талоза, маннит, дульцит, сорбит, инулин, иноЗит, эритрин. Не усваивает.

Протезы, амилазы, лецитиназы. Продуцирует.

Нитраты. Восстанавливает.

Ацетилметилкарбинол, индол, сероводород. Не образует.

Гемолизины. Образует слабо, преимущественно р-гемолизин.

Сероагглютинация. Специфически агглютинируется с сывороткой, полученной к жгутиковому антигену от культур Вас. thuringiensis var. thuringiensis (Berliner).

Продуцирует термостабильный энтомоцидный токсин, активный по отношению к мухам и гусеницам тутового шелкопряда. Перекрёстная сёроагглютинация различных разновидностей спороносных бактерий - продуцентов энтомоцидных токсинов Таблица 1

Антагонистическое действие культур разновидности Арм 647 Гибель тутового шелкопряда от фильтрата культур кристаллофо нов (однократная ежедневная дача гусеницам автоклавированного фильтрата) Таблица 2 Berliner серотипа 1и штамма И ИМИ Тест-культура Таблица 3