Способ одновременного определения комплекса ферментов обмена нуклеиновых кислот Советский патент 1983 года по МПК C12Q1/00 G01N33/48 

Изобретение относится к аналитической химии и может быть использов но для комплексного качественного определения ферментов обмена нуклеиновых кислот. Известны способы определения ферментов обмена нуклеиновых кислот в отдельности. Так, известен способ определения 5 -нуклеотидазы, который основан на . измерении паранитрофенола, образующе гося из паранитрофенилфосфата под действием 5- нуклеотидазы Г3Известен способ определения нукле озидазы, который основан на измерении рибозы, образующейся из нуклеозида под действием нуклеозидазы Известен способ тестирования дезаминазы, который основан на определении, изменения оптической плотности реекционной смеси при 2б5 нм 3j Основным недостатком указанных способов является ограниченность их применения, поскольку данные способы применимы для определения только одного вида фермента. Кроме этого, эти способы не унифицированы и недостаточно специфичны. Наиболее близким по технической сущности и достигаемому результату к изобретению является способ одновременного определения комплекса ферментов обмена нуклеиновых кислот, в частности трех ферментов: рибонуклеотидредуктазы, дезаминазы и нук леозидазы, который заключается в обработке исследуемой пробой, сЪдержащей определяемые ферменты, субстрата в качестве которого используют меченый тритием цитидин ди- или трифосфат, гидролизе образовавшихся йуклеотидов в нуклеозиды при добавлении картофельной апиразы и щелочной фосфатазы и хроматографическом разделении продуктов реакций на катионообменной смоле аминекс А-6 при 50° С и под давлением с последукЛцей их иде тификацией и качественной оценкой определяемых ферментов. Продукты дей ствия указанных ферментов - основания и нуклеозиды разделяются за 50 мин Наличие и наименование ферментов определяют по месту выхода элюирован ных продуктов на хроматограмме 4 Недостатками известного способа являются пригодность известного способа для определения только трех ферментов, т.е недостаточно широкий диапазон определяемых ферментов, а также сложность процесса, заключающаяся в: использовании хроматографии под давлением-, применении сложного и дорогостоящего оборудования (хроматографа под давлением, сцинтилляционного счетчика), применении труднодоступной смолы аминекс А-6, исполь зовании для определения целевых ферментов - дополнительных ферментов апиразы и щелочной фосфатазы и т.д. При отработке технологических процессов выделения различных ферментов (например, полинуклеотидфосфорилазы из E.coli) необходимо быстро и точно определять наличие примесных (сопутствующих) ферментов в грубом экстракте биомассы и по стадиям очистки, чтобы вводить стадии, селективно удаляющие примесные ферменты. При выделении ферментов по отработанной . технологии необходимо следить за качеством ферментных препаратов на стадиях выделения и эффективностью очистки целевого фермента от примесных. Одновременное определение нескольких ферментов, содержащихся в препарате, известными способами невозможно, а каждого в отдельности - занимает много времени, к тому же при совместном присутствии нескольких ферментов эти способы становятся недостаточно специфичными и не позволяют получать правильные результаты. Все это ставит задачу разработки достаточно простого и более универсального способа, позволяющего определять большее количество ферментов. Целью изобретения является упрощение способа и расширение диапазона определяемых ферментов. Поставленная цель достигается тем, что согласно способу одновременного определения комплекса ферментов обмена нуклеиновых кислот, включающему ферментативную обработку субстрата нуклеозид-5 фосфата исследуемой пробой и хроматографическое разделение продуктов реакций с последующей их идентификацией и качественной оценкой определяемых ферментов, разделение продуктов реакций осуществляют тонкослойной хроматографией в системе растворителей диоксан: изопропиловый спирт: 5 М аммиак: 1 М ацетат аммония, взятых в соотношении 30:18: При этом в качестве субстрата обычно используют нуклеозид-5-моно-J диили трифосфаты. В качестве исследуемой пробы обычно используют экстракт или ферментный препарат из Escherichia coli. Благодаря возможностям системы, выбранной для хроматографического разделения компонентов нуклеиновых кислот, которая позволяет разделять до 10 компонентов,.набор определяемых ферментов более широк, чем в изt754вестном cnocofie. При этом сам способ является более простым. . CyiHHOCTia способа заключается в следующем. Под действием указанных в заявке ферментов субстрат (например, АДФ) претерпевает ряд последовательных превращений по°схеме:

1. СПОСОБ ОДНОВРЕМЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ КОМПЛЕКСА ФЕРМЕНТОВ ОБ|5 ---- in ). МЕНА НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ, включающий ферментативную обработку субстрата - нуклеозйд-5 -фосфата исследуемой пробой и хроматографическйе разделение продуктов реакций с последующей их идентификацией и качественной оценкой определяемых ферментов, о т л ичающийся тем, что. с цепью упрощения процесса и расширения диапазона определяемых фермен1юв, разделение продуктов реакций осуществляют тонкослойной хроматографией в системе растворителей диоксан; изопропиловый спирт: 5 М аммиак: 1 И ацетат аммония, взятых в соотношении 30:18: «9:3. 2, Способ по п. 1, отличающийся тем, что в качестве субстрата используют нуклео.зид-5 -моно-, ди- или трифосфаты. 3. Способ по пп. 1и2, отличающийся тем, что в качестве исследуемой пробы используют экстракт Ш1И ферментный препарат из Escherichia соП.

Указанная цепочка взаимопревращений практически всегда является полной, а иногда и длиннее указанной, так как даже в высокоочищенных препаратах ферментов обычно содержится набор примесных ферментов

Способ осуществляется следующим образом.

, В реакционную смесь, содержащую субстрат, добавляют ферментный препарат и инкубируют смесь 20 мин при За время йнкубац1 и исходный субстрат, например аденозин-5 яифосфорная кислота (АДФ ), претерпевает ряд последовательных превращений под действием соответствующих ферментов таким образом, что продукт реакции одного из ферментов является субстратом для другого и т.д.

После инкубации реакционную смесь наносят на пластину Силуфол УФ-25t и проводят хроматографию в системе растворителей диоксан - изопропиловый спирт - 5 М аммиак - 1 М ацетат аммония при соотношении, последних 30:18: 9:3. После хроматографии пластины просматривают в УФ-свете, фиксируЮт контуры пятен, измеряют Rf каждого пятна, идентифицируют продУкты реакции, и по ним качественно определяют наличие тех или иных ферментов.

нуклеозидаза

аденозин |

аденозиндеза- миназа

П р и М е Pi При выделении полинуклеотидфосфорилазы из биомассы E.coli определяют наличие полинуклёотидфосфорилазы и примесных ферментов в грубом экстракте, на стадиях выделения фермента и в готовом продукте. Процедура анализа совершенно од накова для всех стадий технологического процесса и заключается в следующем: к 0,2 мл реакционной смеси, содержащей 0,025 М АДФ в 0,3 М Чбуферном растворе трис-НС1 рН 8,0+0,001 М магний- ацетат+0,001 М ЭДТА, прибавляют 0,020 мл фермента (0,05 мг белка) с каждой стадии очистки. Реакционную смесь инкубируют 20 мин при 37®С, реакцию останавливают-прогреванием реакционной смеси в течение 1 мин в кипящей водяной бане. Контрольную пробу готовят аналогичным

образом, но фермент прибавляют в момент прогревания реакционной смеси. На пластины Силуфол УФ-25 5X15 см шприцом наносят по 10 мкл опытной и контрольной реакционной смеси полосой, ширина которой не превышает 2-3 ММ. Хроматографии проводят в системе растворителей диоксан - изопропиловый спирт - 5 М аммиак - 1 М ацетат аммония (30:18: 9:3). После

хроматографии пластины просматривают в УФ-свете, контуры пятен обводят карандашом, измеряют Rf каждого пятна , идентифицируют образовавшиеся 5101 продукты реакции и по ним качественно определяют наличие тех или иных ферментов. На стадии грубого экстракта биомассы Е.соП обнаружены следующие ферменты: ПНФ-аза, 5 нуклеотидаза нуклеозиддифосфатаза и экзорибонукле аза. На стадии насыщения -сульфатом аммония обнаружены: ПНФ-аза, нуклеозиддифосфатаза и экзорибонукпе аэа, дезамининаза, 5 -нуклеотидаза/ нуклеозидаза. На стадии готового продукта обнаружены: ПНФ-аза, нуклеозиддифосфат-аза и экзорибонуклеаза. В таблице представлены результаты обнаружения ферментов. Поли А О Полинуклеотидфосфорилаза0,38 Экзорибонуклеаза+нуклеозидгдифосфатаза 5 Продолжение таблицы :i::i 21 3 5-НуклеотидАденозиназа Адёнин 0,95 Нуклеозидаза Гипоксантин 0,86 АдениндаааминазаИспользование предлагаемого способа по сравнению с известными позволит: расширить диапазон определяемых ферментов. Предлагаемый способ позволяет одновременно определять шесть ферментов обмена нуклеиновых кислот, упростить способ за счет сокращения стадий способа с 10 до 6, исключения сложного и дорогостоящего оборудования (хроматографа), исключения труднодоступной смолы Аминекс-6 и дополнительных ферментов (картофельной апиразы и щелочной фосфатазы), исключения ионообменной хроматографии под давлением и при температуре.