СПОСОБ ВЫРАЩИВАНИЯ КЛУБЕНЬКОВБ1Х Советский патент 1971 года по МПК C05F11/08 

Изобретение относится к области производства бактериальных препаратов сельскохозяйственного назначения и может быть использовано для приготовления сухого бактериального удобрения нитрагина под культуры лупина и сои.

Для районов стародавнего возделывания бобовых нрибавка от использования нитрагина составляет в среднем 15-25%. Для культур новых в данном районе, для которых в почве нет спонтанных клубеньковых бактерий, эффект от применения нитрагина значительно выше 100% и более.

Известно, что виды клубеньковых бактерий специфичны к растению-хозяину. По скорости роста на питательных средах они делятся иа две грунпы - быстрорастущих и .медленнорастущих. Клубеньковые бактерии лупина (Rhizobium lupini) и сои (Rhizobium japonicum) относятся к медленнорастущим бактериям.

Иитрагин под лупин и сою в настоящее время производят на заводах только в виде почвенного препарата. Между тем способ производства почвенного нитрагина, основанный иа размножении маточной культуры клубеньковых бактерий в почве, слабо механизирован и вытесняется более прогрессивным способом производства сухого нитрагина. Однако последний способ предусматривает производство

сухого нитрагина только из быстрорастущих клубеньковых бактерий с циклом выращивания 48 час. Переход к производству сухого нитрагина включает более интенсивное выращпвание бактериальной массы. И в этом отношении состав среды и условия выращиванпя, позволяющие получать более высокие титры, приобретают важное значение.

Выращивание быстрорастущих клубеньковых бактерий производят на среде с кукурузным экстрактом, сахарозой и благоприятными для этих бактерий исходной реакцией среды (рН 6,8-7,0) и релчимом аэрации (0,4 г/час и

более кислорода на 1 л среды или 1 л воздуха на I л среды в 1 мин). Этот способ может быть применен также для выращивания медленнорастущих клубеньковых бактерий, но он не является оптимальным для этих бактерий

и дает низкий выход биомассы. Бобовый отвар, широко применяе.мый в лабораториях и при выращивании маточной культуры клубеньковых бактерий при производстве почвенного нитрагина, является средой, еще более не

отвечающей требованиям медленнорастущих клубеньковых бактерий.

Таблица 1

Минеральная мел 0,1. Инокуляция

, Одной.иа„изв.естных физиологических особенностей-, медленнорастущих клубеньковых бактерий является подщелачивание питательной среды даотличие.от быстрорастущих, которые ее ;подкисляют. Эта особенность была учтена при разработке предлагаемого способа. Уровень защелачивания среды зависит от ряда факторов и может явиться тормозом дальнейщего развития культуры. Так, на среде с сахарозой происходит нодщелачивание культуральной жидкости до 8 и выще единиц рН и остановка размножения после двух-трех суток, когда количество клеток достигает только 1 - 1,5 млд/мл.

Согласно предлагаемому способу поставленная цель достигается снижением уровня щелочности в ходе развития культуры путем подкисления исходной реакции среды до рЫ около 6,0, введением в питательную среду глюкозы, которая является не только благоприятным источником углерода для клубеньковых бактерий лупина и сои, но и фактором регулирования, реакции среды, и снижением аэрации до 0,1-0,2 г/час кислорода на 1 л среды.

На среде с кукурузным экстрактом и глюкозой при переходе культуры клубеньковых бактерий лупина и сои в фазу замедления роста происходит перелом кривой рН от щелочного максимума (рН 7,3-7,5) в кислую сторону, размножение продолжается в течение 4-6 суток, и максимальная концентрация клеток достигает цорядка 7-12 млд/мл.

Предлагается способ выращивания клубеньковых бактерий лупина и сои на питательной среде, содержащей кукурузный экстракт, минеральные соли калия, натрия, магния, кальция и фосфора и источник углерода при аэрации и температуре предпочтительно 27-29°С. При этом способе в качестве источника углерода и регулятора реакции среды берут глюкозу, реакцию среды доводят до рН 6,0-6,2, а аэрацию поддерживают из расчета 0,1 - 0,2 г/час кислорода на 1 л среды.

Предлагаемый способ был апробирован в лабораторных и заводских условиях и показал, что он позволяет получать выход живых клеток Rhizobium lupini и Rhizobium japonicum в 6-10 раз больще, чем при использовании известных ранее способов выращивания клубеньковых бактерий.

В табл. 1 приведены титры бактерий после четырех дней глубинного культивирования.

Выращивание медленнорастущих клубеньковых бактерий предлагаемым способом даст снижение себестоимости урожая бактериальной .массы в 6-10 раз по сравнению с другими способами, приведенными в таблице.

Пример осуществления способа.

Приготовлено 1,3 л питательной среды согласно прописи: 7,8 г кукурузного экстракта растворили в 1 л водопроводной воды. После кипячения в течение 20 мин. отфильтровали, довели объем до 1 л, внесли по 13 мл 5%-ных растворов (Nn4)2SO4 и К2ПРО4 и 2%-ных растворов NaCl и MgSO4, добавили 13 г глюкозы, довели объем воды до 1,3 л. рН 6.20. Добавили 1 мл 7%-ной ПС1 до рП 6,05. Разлили в три колбы для выращивания на 750 мл по 400 мл среды и добавили но 400 мг мела и в колбу на 250 мл со 100 мл среды без добавления мела - для получения жидкого посевного материала. Среду простерилизовали - больщие колбы при 1 атм в течение 45 мин, малую при 1 атм в течение 20 мин.

Определили в отдельной пробе рН среды после стерилизации 5,98. основа, %: К2НРО4 0,05; (NH4)2SO4 0,05; NaCl 0,02; MgSO4 0,02; 40 млн/мл, температура28°С. высеяли на чистоту (на косяк МПА), определили рН и титр в посевной колбе (подсчет в камере Горяева). рН 6,99, титр 2500 млн/мл. Внесли в каждую из трех опытных колб по 6,5 мл из посевной колбы, что составило 40 млн/мл. Колбы с 400 мл засеянной среды поставили на большую круговую качалку с 160 об/мин, что обеспечивало скорость растворения кислорода 0,15 г/л час. Температура инкубации 28°С. Через четыре дня выращивание закончили. Определили конечное рН в колбах. Таблица 2 титр по камере, чистоту культуры и сделали высев на маинпто-дрожжевую твердую среду для определения количества живых клеток. Чашки Петри поставили в термостат во влажиой камере. Через 10 дней просчитали колонии и вывели титр. Результаты приведены Е табл. 2. Предмет изобретения Способ выращивания клубеньковых бактерий лупииа и сои на питательной среде, содержащей кукурузный экстракт, минеральные соли калия, натрия, магния, кальция и фосфора и источник углерода, при иейтральном значении реакции среды, аэрации i температуре предпочтительно 27-29°С, отличающийся тем, что, с целью повышения выхода биомассы, в качестве источника углерода и регулятора реакции среды берут глюкозу, реакцию среды доводят до рН 6,0-6,2, а аэрацию поддерживают из расчета 0,1-0,2 г/час кислорода на 1 л среды.