СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ КОНИДИЙ ГРИБА BEAUVERIA BASSIANA (BALS.) VUILL.ВСЕСОЮЗНАЯПАТЕНТНО-Т?ХН^"Е:КДНЬИБЛМОТЕКА Советский патент 1971 года по МПК C12N1/14 

Известно несколько способов получения патогена для насекомых на основе гриба В. bassiana.

Использование в качестве патогена гонидий (бластоопор), образуемых этим грибом в глубинной культуре, несмотря на простоту способа их получения, не нашло -практического применения, поскольку гонидий, являясь вегетативной формой размножения гриба, очень чувствительны к воздействию неблагоприятных внешних условий и менее патогенны, чем конидии.

Поэтому в качестве патогена для насекомых, как правило, используют конидии, которые получают поверхностным способом.

Известен также способ получения конидий гриба В. bassiana на поверхности жидкого питательного субстрата в стационарной культуре.

Суть известного способа заключается в следуюш,ем.

Некоторое количество зерна, например кукурузы, в течение 1 час кипятят в утроенном количестве воды. К полученному отвару добавляют 1% сахара, 0,2% азотнокислого натрия (калия) или пептона и антибиотик (стрептомицин). Готовую среду слоем 5-7 см разливают в чистую посуду, которую закрывают бумагой. Среду обильно засевают конидиями гриба. Культивирование ведут при температуре 22-26° С. Через 14-20 дней на поверхности питательной среды получают конидиальные пленки гриба, которые используют для приготовления препарата.

Основными недостатками известного способа получения конидий гриба В. bassiana являются низкая продуктивность, длительность процесса получения конидий, потребность в больших плош,адях для массового культивирования гриба, высокая стоимость питательной среды, вероятноегь частых загрязнений последней посторонними микроорганизмами, обусловленная медленным ростом гриба и оказываюш,ая отрицательное влияние на продуктивность и вирулентность конидий, значительные затраты посевного .материала, большие затраты тепловой энергии на приготовление среды, возмолсность возникновения аллергических явлений среди обслуживающего

персонала, связанная с поверхностным ростом гриба.

Перечисленные недостатки делают известный способ трудоемким и мало рентабельным. Несовершенство известного способа получения конидий гриба В. bassiana препятствует организации промышленного производства препарата боверина.

Эта цель достигается тем, что в отличие от известного способа конидии гриба получают непосредственно в жидкой питательной среде в глубинной культуре. Культивирование гриба до массового образования конидий ведут в стерильных условиях в течение 60-70 час при температуре 28-29° С и непрерывной аэрации, интенсивность которой в период массового конидиеобразования понижают, в органосинтетической -среде с нейтральным или слабощелочным исходным рН, содержащей 2% сахара, 0,2-0,5% азотнокислого натрия, 0,2- 0,5% фосфорнокислого калия, 0,05-0,2% сернокислого магния и не более 30 мг % аминного азота, источником которого могут служить, в частности, кукурузный экстракт или пивное сусло. Густота засева конидиями питательной среды 0,5-1,5 млрд 1л, рН среды около 8.

Содержание аминного азота в питательной среде является одним из факторов, влияющих на репродуктивное размножение гриба В. bassiana (образование конидий) в глубинной культуре.

Отсутствие в синтетической питательной среде аминного азота приводит к слабому разрастанию мицелия и незначительному конидиеобразованию (количество конидий не превышает 30 млн/мл).

Чрезмерное содержание аминного азота в питательной среде (более 30 мг %) способствует вегетативному размножению гриба - образованию гонидий.- На среде, содержащей 55-60 амийного азота кукурузного экстракта (2%), отмечается только образование гоЕидий. На среде с пивным суслом (35- 40 мг°/о аминного азота) параллельно происходит образование конидий и гонидий.

Оптимальным содержанием ъ среде аминного азота, способствующим хорошему конидиеобразованию лри слабом образовании гонидий, является 10-15 мг% для пивного сусла и 4-10 мг% для кукурузного экстракта.

В качестве пеногасителя применяют растительное масло. Масло в питательную среду вводят частями, по мере вспенивания питательной среды и потребления масла грибом, при этом общий расход масла не должен превышать 0,2%, в противном- случае развитие гриба идет в сторону образования гонидий.

Питательную среду стерилизуют в ферментере при температуре 120° С в течение 30- 40 мин.

Для засева питательной среды готовят конидиальную суспензию, при этом в колбу с конидиями наливают стерильную воду и шуттелируют на качалке в течение 1-2 час для получения равномерной суспензии. Затем определяют титр суспензии и производят расчет посевного материала.

После охлаждения питательной среды ее засевают конидиальной суспензией гриба из расчета 0,5-1,5 млрд/л.

нудительной аэрации, интенсивность которой в период разрастания мицелия (О-20- 30 час) устанавливают равной 0,75-0,8 объема воздуха на 1 объем аэрируемой среды в 1 мин при механическом перемешивании среды. В период образования конидий интенсивность аэрации понижают до 0,3-0,4 объема воздуха на 1 объем аэрируемой среды в 1 мин без механического перемещивания среды. Такой режим аэрации благоприятствует образованию конидий.

При культивировании гриба ведут обычный микроскопический контроль чистоты культуры и степени развития гриба.

В начальный период культивирования происходит прорастание конидий и разрастание мицелия, количество которого через 20-30 час достигает 6-8 г на 1 л среды. Затем на мицелии образуются бутылевидные конидиеносцы,

расширенные у основания и вытянутые к вершине в виде тонкого волокна. Коиидии вначале образуются на дистальяом конце конидиеносца, а затем на небольших боковых стеригмах.

Форма конидий округлая, размер 2,8Х Х4,0 мкм. Характер образования конидий в глубинной культуре не отличается от образования их на поверхности питательного субстрата. Форма и размер конидий такие же,

каК и при образовании их на поверхности.

В отличие от конидий гонидий образуются путем отчленения от мицелия боковых отростков или расчленения мицелия. Форма гонидий цилиндрическая, размеры (5--7)Х(7-

-14) мкм.

Культивирование заканчивают, когда количество конидий в культуральной жидкости достигнет максимума, т. е. когда дальнейшее продуцирование их прекращается. При этом

отмечается частичный автолиз мицелиальных клеток, количество которых постепенно уменьшается.

Предлагаемый способ получения конидий гриба В. bassiana апробирован в лабораторных условиях. приведены результаты этих испытаний.

Пример 1. Культивирование гриба вели в среде, содержащей 25% пивного сусла, 0,2% фосфорнокислого калия, 0,05% сернокислого

магния и более 30 мг % аминного азота (последнее определяли формольным титрованием). Исходное рН среды было 6,0. Культивирование вели при температуре 28° С и постоянной аэрации. Через 90 час культивирования

титр конидий составлял 46 млн/мл, гонидий- 128,75 млн/мл.

Б данном случае гриб одновременно продуцировал два типа клеток, что объясняется большим содержанием аминного азота в среДе.

Полученные клетки (конидии и гонидий)отделяли от культуральной жидкости и определяли вирулентность их по смертности гусениц яблонной плодожорки V возраста. Смертность особь составляла на 15-й день 13%, на 30-й день - 25%, в варианте с заражением гусениц поверхностными конидиями - соответственно 65 и 88%. Приведенные данные но:казывают, что в ереде с большим содержанием пивного сусла происходит одновременно образование конидий и гонидий, вирулентность полученного на такой среде материала была ниже вирулентности поверхностных конидий. Пример 2. Культивирование гриба вели на среде, содержащей 0,5% азотнокислого натрия, 0,5% фосфорнокислого калия, 0,2% сернокислого магния, 2% сахара, 0,4% кукурузного экстракта и 8 мг % аминного азота. Культивирование вели в течение 80 час при тех же условиях, что и в предыдущем примере. Образование конидий в этом случае было преобладающим, и к концу культивирования количество их достигло 2040 млн/мл; гонидий при этом было 184 млн/мл. Пример 3. Культивирование вели на среде, содержащей 0,5% азотнокислого натрия, 0,5% фосфорнокислого калия, 0,2% сернокислого магния, 2% сахара, 2% пивного сусла и 12,5 мг% аминного азота (последнее определяли -формольным титрованием). Исходное рП среды 8,1, густота засева конидиями 0,75 млрд/л, температура культивирования 28° С. В течение первых 30 час культивирования интенсивность аэрации была 0,8 объема воздуха на 1 объем среды в 1 мин с механическим перемещиванием среды, затем ее понизили до 0,4 объема воздуха на 1 объем среды в 1 мин без механического иеремещивания среды. Через 68 час культивирования количество конидий достигло 456 млн/мл, количество гонидий было 0,5 млн/мл. При дальнейшем культивировании титр конидий не увеличивался. Выход стандартного препарата с 50 л ферментера составил 15,2 кг. Полученные предлагаемым способом конидии хранили и испытывали на жизнеспособность и вирулентность в двух формах -жидкой и сухой. Жидкая форма представляла собой конидии в культуральной жидкости, сухая форма - конидии, отделенные от культуральной жидкости путем сепарирования и высушенные при температуре 30° С. Сопоставление в процессе хранения жизнеспособности конидий, полученных предлагаемым и известным способами, показало, что через пять месяцев хранения в обоих случаях процент жизнеспособных -конидий был одинаков. Токсикологическая оценка конидий, полученных в глубинной культуре, приведена в таблице. Из данных таблицы видно, что при дозированном заражении насекомых конидии, полученные предлагаемым способом, по вирулентности не уступали конидиям, полученным известным способом, в отношении гусениц яблонной плодожорки и имаго клопа - вредной черепашки; в отношении личинок колорадского жука глубинные конидии уступали по вирулентности поверхностным. Однако при обработке корма глубинными конидиями, сохранявшимися в жидкой форме в течение четырех месяцев, отмечена высокая смертность личинок колорадского жука П1-Iv возраста (93,3%). Изменение вирулентности конидий в процессе хранения показано в таблице. Из таблицы видно, что конидии, полученные как поверхностным, так и глубинным способом, через пять месяцев хранения в равной степени патогенны для насекомых. Сухие гонидий, высушенные при температуре 30 С, нрактически не обладали патогенными свойствами-смертность имаго клона- вредной черепашки при дозировке 16,6 млн на одну особь на lS-й день опыта составила 187о и не отличалась от естественной смертности в контроле. Хранение гонидий в жидкой форме в лабораторных условиях (температура 15-22 С) не представлялось возможным, носкольку происходило образование грибной конидиальной пленки на поверхности культуральной жидкости, что исключало возможность инфицирования -насекомых гонидиями. Проведенные опыты показали, что конидии, полученные предлагаемым способом, по показателям вирулентности и продолжительности хранения не отличались от конидий, полученных известным способом; гонидий по этим показателям значительно уступали конидиям. Предлагаемый способ прост в осуществлении и не требует специального оборудования. Он может быть осуществлен на люоом предприятии, выпускающем микробные препараты. Сравнительные технико-экономические показатели известного и предлагаемого способов получения конидий гриба В. bassiana приведены ниже. Основными достоинствами предлагаемого способа в сравнении с известным являются получение конидий непосредственно в глубинной культуре, уменьшение вероятности загрязнения питательной среды посторонними микроорганизмами, улучшение санитарно-гигиенических условий труда, поскольку культивирование гриба проводят в закрытых ферментерах. Использование предлагаемого способа позволяет сократить продолжительность получения конидий в 5-8 раз, повысить продуктивность в 6-46 раз, новысить производительность способа в 26-300 раз, понизить стоимость питательной среды в 2-4 раза, понизить расход посевного материала в 18 раз, снизить затраты тепловой энергии в 5- 44 раза.

Сравнительные показатели вирулентности конидий гриба В. bassiana.