Набор для колориметрического определения холестерина в крови и других животных тканях Советский патент 1924 года по МПК G01N33/52 

Предла1аелк е изобретение предн.,значается лля количественного колори тетрического определения холестерина в крови и тканях больных с нарушением обмена веществ.

На чертеже фи1. 1 изображает йид набора спереди, фиг. 2 - вид сверху, фиг. 3 - вертикальн1)1й поперечный разрез и фиг. 4 - две проекции реактивного цилиндра.

Определение с но.мощью предлагаеЛ1ОГО набора производится непосредственно путем сравнения пветового то на хлорофор.менного с.тоя реакции н: холестерин с цветны.ми тона.ми штаь;дартных растворов, различных концентраций красителя «Бензобраун«, Общества красочных занодов, б. Фр. Байер и К°. Результаты сравнения, .. .теменные по И1кале прибора, показывают количество холестерина в 1 с/и данного вещества, выраженное в мил лигра.ммах.

Определение холестерина производится по методу, основанному на видоизмененной авторо.м реакции Залковского. Основным тоном П1т;ндартного раствора является желто-оранжевым, который ко.1еоле1ся соответственно разны.м количествам холестерина в упомянуто реакц:;и от светло-желтых оттенксм в слабых разведениях до оранжево-красных в бодее сильных. Каждая градация штандартного раствора красителя строго соответстнует цвету х.юрофор.менного слоя реакции Залковско1(), проведенной безводно с известными количес1ваАИ1 чистого холестерина.

Прибор состоит из:

1)запаянных стеклянных цилиндров 11 с илоским дном, имеющих одинаковые размеры и содержаниях цвотную жидкость;

2)peaKTiiBHOio цилпн.тра /. тех же размеров;

3)окрашенного бело11 краской И1татива с тремя полка.я1, в которых проделаны отверстия для вставления цилиндров, при че.м цилиндры с и1танлартН1 1.ми растворами располагаются через одно отверстие, чтобы между ни.ми могли вставдяться реактивные цидинлр1 1 для сравнения;

4)футляра с j pbiiHKofi для предохранения а. от действгтя света.

Цветная жидкость, заключающаяся в цилиндрах, представляет собою разведения красителя Beiixo-braim ) 3 G Вауега в 70% спирту. Указанный краситель способен давать все цветовые оттенки, соот:ветствую цие тонам реакции Залковского на холестерин, от 0,1 мг до 10 тг.

Притотовление разведений этого красителя распадается на три мол1енга: а) приготовление основного раCTBOipa; Ь) приготовление спиртовых разведений красителя, соответственно реакции Залковского на чист1 |й холестерин; с) установка этих разведений. Точно отвешивается определенное количество красителя, с расчетом получения 4% раствора в 70% спирту, т.-е. 1,25 г красителя на 100.0 г 70% чистого спирта. Полученный раствор оставляется, для лучшего растворения красителя, на несколько часов (6-8), при Постоянном взбалтывании, затем.

фильтруется и хранится в теплом месте.

Приготовленный таким образом раствор красителя имеет вид прозрачной жидкости интенсивного оранжевокрасного цвета. При приготовлении разведений цветовой раствор от.меривается каплями, при по.мощи пипетки с диаметром отверстия 2 тм с резиновым шариком; один куб. см основного раствора красителя содержит 56 капель, отсчитанных этой пипеткой.

Приготовление растворов различных концентраций красителя. соответственно тона.м реакции на чистый холестерин, производится иутем дальнейuiero разведения основного раствора в 70% сгшр1у. Расчет для каждого оттенка производится в каплях красителя 100,0 куб. C.W 70% спирта. Таки.м образом, таблица приготовления разведений краски выражается следующим образом:

Приготовленные растворы, во избежание возможного испарения спирта тотчас же разливаются BI цилиндры и запаиваются.

Установка разведений красителя слагается, в свою очередь, из двух моменj-OB: 1) постановки реакции Залковского на чистый холестерин в количествах от 0,1 до 10 /иг и, 2) проверки полученных разведений цветовых раCTBOipOB красителя с тонами соответствующих реакций на холестерин.

Цветовая шкала растворов набора. начиная от слабо-желтых оттенков, соответствующих содержанию холестерина в децимиллипраммах, переходит в желтые тона, npvr содержании холес:терина до 2-х .tir, желто-оранжевые до 4-7 Л1Г и оранжево-красные выше 7-ми тг. У каждой ампулы имеются цыфровые обозначения, указывающие непосредств енно соответствхтощее количество холестерина, выраженное в :миллиграммах (pixi inille - /оо)- Например, если по указанному методу берется для исследования 1 куб. см сыворотки и при сраБ1нени1и получается сходство оттенка хлорофор.менного слоя реакции с ампулой, имеющей обозначение , то содержание чистого холестерина в 1 куб. cm данной сыворотки равно 0,0015 тг или 1,5 г на литр сыворотки.

Определение холестерина в кровяной сыворотке и тканях, с помощью предлагаемого прибора, слагается из: а) приготовления исследуемого материала, б) обрабочки его, в) реакции, г) колориметрического определения количества холестерина в исследуемом материале. Успех этих определений зависит от ти1ательиости выполнения указанных деталей и условий постановки; опыта, а также от чистоты и качества реактивов. Для получения сыворотки берется кровь в количестве 5-10 куб. c,w из

локтевой вены у человека, пз v. jugula. Iis у собак и кошек и из уха или cepjuii у кроликов. Кровь необходимо брать натощак. Во избежание гемолиза крови, иробирки и шприц должны быть или совершенно сухими, или проли ггы физиологическим раствором. Сыворотку желательно исследовать по воз.можности в свежем виде (не позже 2-3 дней после взятия крови). Гемолизированные и содержащие эритроциты сыворотки рекомендуется не употреблять для опыта. . Полученная обычныл способол (стояние крови на холоду, центрофугирование) прозрачная сыворотка сличается в чистую пробирку и подвергается дальнейшей обработке. Для этог:о от.меривается, с по.мощью сухой градуированной пипетки, 1 луб. см прозрачной сыворотки и прибавляется каплями в широкогорлую склянку с притертой пробкой, емкостью В 30- 25 куб. см, в которую предварительно наливается 5 куб. см абсолютного алкоголя. Сыворотка, соприкасаясь с алкоголем, превращается в мелкий хлопьевидный осадок. Последний слегка размешивается в спирту осторожным иокачиваниед банки или же продувание.м воздуха через пипетку. Затем, склянка тотчас же ставится в сушильный шкаф с температурой не менее 55-60° С, до полной отгонки спирта

11полного высыхания остатка. Только при такой те.мпературе сухой остаток пре| ращается в цельную, легко отстающую от дна склянки корочку, сле1-ка желтоватого цвета и почти прозрачную. Более низкая температура дает или а.морфпую белую массу, которая может заключать в себе остатки влаги, или прилипание корочки ко дну склянки. Первое влияет на изменение цвета реакции в сторону розоватых тонов, второе может влиять на точность исследования. Точно также, более высокая температура ускоряет отгонку спирта и уменьшает, таким образом, его обрабатывающее действие. Отгонка обычно продолжается от 6 до

12часов.

Полученный сухой остаток сыворотки измельчается в банке при помощи металлического шпателя, высыпается в

хорошо высушенную ступку, тщательно растирается и снова высыпается обратно в банку. Плотно приставшие к бокам банки частицы во время реакции смываются и растворяются хлороформом и серной кислотой.

Сыворотку, в виде сухого остатка и непременно в тех же склянках, можно сохранять неопределенное время в эксикаторе или при обычных условиях в лаборатории, но в последнем случае ее необходимо повторно просуаппъ перед реакцией, которая производится с остатком сыворотки, обработанной только алкоголем. Другие составные части плаз.мы (лецитин, глобулин, соли и проч.) особого значения для реакции не и.меют, так как эти вещества, если даже и извлекаются, то характерного тона этой реакции не дают.

Реакция производится следующим образом. В банку, содержащую превр;щенную в порошок сыворотку, точно отмеривается 5 куб. сл1 чистого хлорсфор.ма и равный обел-v-химически чистой концентрг рованной серной KIIслоты. Смесь осторожно взбалтывается покачиванием банки в течение L - 1 мин. до появления желатино-подобнсго вида массы и ставится в темное по.ме1цение, приблизительно, иа 2 часа, до отстаивания хлороформенного слоя. После того, хлороформенный слой сливается в хорошо высушенную пробирку одинакового размера с запаянными цилиндрами прибора, закрывается пробкой и сравнивается с оттенками растворов красителя.

Правильность получения резу.тьтатов реакции находится в зависимости от качества реактивов, температуры и безводного протекания реакции.

Качество серной кислоты имеет особенно важное значение. Необход пю пользоваться серной кислотой химически чистой, концентрированной, с удельным весом 1,846. Кислота с удельным весом, содержащая больший процент воды, влияет на изменен1е цветового тона реакции, переводя нормальные желтые тона в розоватые и даже фиолетовые оттенки. Обычно в реакции тон слоя хорошей серной кислоты бывает почти одинаковой пнтенс1гвност11 с тоном хлороформенного слоя или несколько темнее. О качеове серной кислоты можно судить по тону хлорофор.менного слоя реакции, который в соответ ствующих дозировках холестерина не должен уклоняться от оттенков нроверенных тонов.

Перед началом ра,боты желательно проверить «ачестБО хлороформа. Прсверка производится тем же способом. icaK и проверка серной кислоты. Ставится реакция Залковского с чистым холестериеом, и при соблюдении указанных она должна дать определенное соотношение оттенков хлороформекного слоя и слоя серной кислоты. Хорошето качества хлороформ не должен давать быстрого обесцвечивания розовых оттенков; кроме того, он должен соответствовать тем или друГИ5М оттенкам цветовой шкалы набора. Для обработки сыворотки по предлагаемому методу необходим безводный, по возможности, алкого.пь. При приготовлении абсолютного алкоголя путем обезвоживания прокаленным порошком медного купороса, необходимо следить за те:51, чтобы он совершенно не содержал частиц та1кового, так как последние могут влиять на изменение цветового тона реакции в сторону розоватых оттенков. Это может быть обяснвно тем, что попавшие в; сыворотку частицы медного купороса при обработке алкоголя забирают воду из нее и удерживают ее при температуре 55-60 в термостате, в реакции же они, повидимому, отдают частицу кри.сталлизационной воды серной кислоте. Температура имеет значени е, главным образом, для реакцИИ с чистым холестерином. При этом максиму.м тона наступает: при температуре Ю - через 20 минут, при температуре 12- 15° - через 15 минут, при температуре 20°-через 10 минут.

При более длительной реакции, незаВИСИЛ1О от температуры, наступает изменение цветовых тонов реакции.

Реакция на холестерин с сывороткой обычно достигает максимулш через .-1 ч. при температуре 10- 14° С и должна проводиться в возможТипо-яитограЪия HI JHTI IIKS, Лр:И1нг)а;1„ ождупародьый. 7.5.

но сухом виде, вследствие чего реактивы должны быть, по возможности, безводны, кроме TOio, необходи.мо избегать попадания влаги из воздуха, плохо высушенной сыворотки и посуды.

Определение количества холестерина, содержащегося в исследуемой сыворотке, производится сравнением тона хлороформенного слоя реакции с тоналги растворов красителя. Для эпхзго, по прошествии определенного времени, хлороформенный слой сливается в маленькую пробирку, одинаковой толщины стекла и емкости с таковыми в приборе, закрывается пробкой и вставляется в штатив, для сравнения с теми или иными тонами красителя, ксл орое должно производиться быстро, так как при продолжительно. стоянии мсжет последовать изменение оттенка.

Сравнение лучше производить при дневном свете, падающем перпендикулярно к плоскости прибора, и на урпвне глаз исследователя.

Для определения ко.тичества холестерина в кровяной сыворотке достаточно брать на реакцию 1 куб. ся сыворотки; но в некоторых С-тучаях. где почему-либо взятие крови в больиюм количестве сопряжено с больигими трудностями, можно обходиться и с 0,5 луб. еж сыворотки, соответственно уменьшая количество реактивов в два раза.

п р ; д SI Ет п ..т ; и т .л.

Набор для колориметрического определения холестерина в крови и других животных тканях при помощи проведенной безводно реакиии Залковского, отличающийся тем. что он состоит из ряда запаянных стеклянных цилиндров, имеющих одинаковые размеры, содержащих растворы различных концентраций красителя «Бензобраун, Общества красочных заводов, б. Фр. Байер и К , а равно из одного или нескольких таКИх же размеров открытых стеклянных реактивных цилиндров для сравнения оттенка испьпуемого холестеринового раствора с оттенками раствО|ров указанного красителя.

k/

1:.ш1 -Ааш:.

Ш

лж

5Ж1

. J да

i I

/V J

.jL;uOOOOOO I

р