ПАТЕНТНО-- ^ Т>&л1}1ЧЕП;Д^ 5 F::5A^OYcKA Советский патент 1972 года по МПК G01N21/78 

Известный способ количественного определения этилового сиирта в тканях живых оргаиизмов состоит в обработке исследуемы.х материалов смесью, в которую входят никотинамиддодениндинуклеотид (НАД), алкогольдегидрогиназа (АДН), буффер, реагент основного характера, стабилизатор, а также агент, связывающий альдегид, наиример семикарбазид. Ферментативный метод основан на следуюн1ен химической реакции:

CsHsOH-f НАД СНзСОО + НАДН + И+.

Превран1. спирта в ацетальдегнд идет до коица при условии, что носледннй продукт связывается и реакция осуществляется в щелочном растворе. В ирисутствин адекватных количеств алкогольдегидрогипазы (АДН) этанол окисляется в ацетальдегид с образоваиием восстаиовлеииого НАД, который поглощает свет нри длине волны 340 ммк. Измеренне колнчественного изменення в поглощенгщ света нозволяет вычислить количество спирта, превращенного за время анализа, и таким образом определить его концентрацию.

Ранее используемые агенты для связывания НАД, например семикарбазид в виде соли хлористоводородной кислоты (NH2-СО- -NH-NHg-HCl), имеют тот недостаток, что они образуют комплексы с НАД, которые вноследствии препятствуют ферментативному оиределеиию в связи с тем, что комплексы могут портиться при старении, давая иеиравильные фотометрические показатели.

С целью устрапеиия указанного недостатка, а также сокращения времени анализа и повышения .его точности, предлагается в качестве агента, связывающего альдегид, применять аминооксиалкановые кислоты, которые имеют от 2 до 5 атомов углерода, или аминооксиалкансульфокислоты, имеющпе до 4 атомов углерода.

Скорость иерехода водорода в реакции НАД с этаиолом является функцией иескольких факторов в реакцпоииой смеси. Когда все факторы нрнсутствуют в оит1 мальных количествах, эта скорость зависит прежде всего от скорости удалення ацетальдегнда. Реакцня протекает медленно, когда в качестве улавливающего агента исцользуется семикарбазид. Время до конца реакции с семикарбазидом составляет 30-60 мин. Обнаружено, что апалогн гидроксиламина снособствуют значительио более быстрому протеканию реакции. Например, в реакциониой смес, содержащей 0,035 моль ади1нооксиуксусной KiiCviOTbi, реакция идет 5- 15 мин в зависимости от количества присутствующего этанола. В этом и состоит преимущество предлагаемого способа - сокращение времени реакции без потери точности, особенно тогда, когда требуются частые и быстрые анализы спирта. Алкогольдегидраза (АДН) является одним из менее стабильных энзимов, поэтому лиофилизация энзима обязательна. С т а б и л и 3 а ц и я энзима. Уменыненле иотери активности до мннимума во время лиофилизации и носле достигается суспендированием кристаллического энзима в растворе, который содержит стабилизирующие и активирующие вещества, например: Вода, мл100 Камедь акации, г5,0 Никотинамид-адениновый динуклеотид, мг15 Хлоргидрат цистеина, лг50 Глицин, г1,5 Альбумин, г1,0 Г; ис-версоловая буфферная смесь при рН 8, мл5,0 Алкогольдегидраза100000. Данный раствор тщательно сушат при температуре ниже 0°С и затем нереиосят в обез- 25 воженную атмосферу. Потеря активности при этом составляет меньше 10%. Предпочтительными агентами, связывающими альдегид, являются аминооксиалкановые кислоты, особенно аминооксиуксусная кислота. 30 Они очень устойчивы при однородном смешении с реактивными компонентами. Кроме того, найдено, что аминооксиалкановые кислоты можно использовать в более широком диапазоне концентраций но сравнению с семикарба- 35 Реактив, применяемый для анализа этанола в тканях живых организмов, состоит из сухой смеси следующих веществ: Энзим алкогольдегидраза пирофосфат, соль щеБуфферная смесь лочного металла Стабилизатор глицин и альбумин аминооксиуксусная улавливающий кислота карбонат натрия нейтрализующий Коэнзим никотипамид-адеииновый дииуклеотид. Первая стадия приготовления реактивной50 смеси заключается в определении количества нейтрализующего агента, например карбоната натрия, нужного для нейтрализации кислотности новых улавливающих агентов. С этой целью готовят две смеси, которые включают еле-55 дующие химические вещества, мг: Высушенный пирофосфат натрия400 Аминооксиуксусная кислота200 Глицин100 Альбумин27. 5 10 15 20 40 45 60 это количество карбоната натрия добавляют ко второму раствору и снова измеряют рН с целью проверки. Количество безводного карбоната натрия, обычно требуемое для получения необходимого интервала рН, составляет около 280 ,«г для вышеописанной смеси. Вторая стадия состоит в определении алкогольдегидразы, которую вводят в объединенный реактив. Это определение можно сделать любым методом, описанным в литературе, нричем активность АДН устанавливается в международных единицах (М. Е.) на 1 мг лиофилизированного энзима. Необходимо такое количество энзильного препарата, которое бы обеспечивало активность порядка 200 М. Далее готовят опытную партию в зависимости от количества карбоната натрия и АДН, определенных вышеуказанным способом. С этой целью в сухом виде смешивают следующие ингредиенты (их однородность достигается размалыванием), мг: Нирофосфат натрия400 Аминоксиуксусная кислота200 Глицин100 Альбумин27 Алкогольдегидраза (200 М. Е./мг) 1 Никотинамидадениновый динуклеотид31,6 Карбонат натрия 280 Всего 1039,6 Для подтверждения пригодности данной смеси для анализа этилового спирта в биологических жидкостях часть порошка весом ПО- 120 мг полностью растворяют в 2,6 мл дистиллированной воды в оптической кювете со световым пробегом 1 СЛ1. Для того чтобы установить уровень активности, создаваемой самими реактивами, т. е. реактивной пробой, кювету помещают в фотометр, допускающий измерение поглощения света при длине волны 340 ммк. Поскольку реакция п эекращается, когда все вещество (а именно спирт) прореагировало, нет необходимости поддерживать постоянной температуру в кювете. Однако для качественного контроля при производстве данного продукта полезно сравнивать активности различных партий при одной и той же температуре. Для аналитических целей выбирают температуру 30°С, хотя можно использовать любые температуры между 25 и 37°С. Кювету, содержащую реактивный раствор, оставляют в фотометре, и измеряют поглощение при 340 ммк 30 мин с интервалами 5 мин. Удовлетворительная реактивная смесь будет показывать поглощающую способность, которая увеличивается со скоростью не больще, чем 0,001 в 1 мин для пробы. Далее реактивную смесь испытывают с помощью анализа эталона этилового спирта.

разбавляют 49 частями дистиллированной воды. Порцию реактивного порошка весом ПО- 120 мг растворяют в 2,7 мл дистиллированной воды для использования в качестве реактивной пробы. Вторую порцию 110-120 мг растворяют в 2,6 мл дистиллированной воды. Разбавленный спиртовой стандарт (0,1 мл) добавляют к последнему раствору, смешивают и оставляют стоять около 5 мин. Фотометр устанавливают на нуль, снимая показания на месте с реактивной пробой. Затем измеряют поглош,ение стандартного раствора. Эти стадии повторяют с интервалами 5 мин. до тех пор, пока два последовательных показания стандарта не будут отличаться на 0,005 или меньше.

Обычно реакция заканчивается за 10 мин. Конечное показание поглощения является численно равным содержанию спирта в весовыхобъемных процентах. Выход спирта должен быть 100±10% добавленного количества для удовлетворительного анализа.

Окончательно реактив готовят из двух смесей следующего состава, г; Первая смесь

высушенный пирофосфат натрия 400 аминооксиуксусная кислота200

карбонат натрия безводный280

Вторая смесь

глицин100

альбумин27

алкогольдегидраза лиофилизированная1.

Оба порошка затем объединяют и смешивают для получения гомогенной смеси. Количество данного порошка (1,1 г) растворяют в 30 мл дистиллированной деионизированной воды и измеряют рН. Для данного анализа удовлетворительным интервалом рН является 8,8- 9,2. Активность раствора устанавливают с помощью анализа спиртового стандарта, как описано выше. Законченный реактив в сухом порошкообразном виде готов для упаковки в единицы, каждая из которых обеспечивает все реагенты, необходимые для одного анализа спирта, при растворении в 2,6 мл воды.

Пропорции или количество компонентов реактива, предназначенного для использования, можно изменять, так как изобретение скорее включает новое сочетание ингредиентов, чем какие-либо критические пределы. АДН, например, должна присутствовать в количестве, достаточном для окисления всего спирта, который необходимо определить. То же самое относится к другим компонентам реактива.

Ферментативную оценку спирта можно прнменить ко всем тем системам, которые содержат или выделяют этанол, не тормозят активности АДН или не препятствуют поглощению света при длине волны 340 ммк. Так, данный анализ можно использовать при оценке актипности трипсина. Трипсин гпдролизует субстрат-бензоил-аргининэтпловый эфир. Скорость выделения спирта, измеряемая по реакции АДН, будет мерой, активности трипсина. Аналогичным образом может определяться активность других энзимов, таких как протеазы или эстеразы, которые выделяют этанол, пронанол или бутанол.

Аминооксисоединення, например аминооксиуксусная кислота, также имеют значение как

агенты, связывающие альдегид и в других ферментативных анализах. Конкретным примером является определение молочной кислоты. Когда объединяют лактат дегидразы, НАД и аминооксиалкановую кислоту с подходящим

буферным раствором, стабилизатором и нейтрализующим агентом, как описано выше, получают удобный реагент для количественного определения молочной кислоты. Аналогично можно аналнзировать (З-оксимасляную кислоту

замещением р-оксибутирата дегидразы вместо АДН.

Все варианты анализа, согласно изобретению, включают превращение коэнзпма из одной формы в другую, что сопровождается оптическим поглощением при определенной длине волны.

Предмет изобретения

Способ количественного определения этилового спирта в тканях живых организмов обработкой исследуемого материала смесью из никотинамиддодениндинуклеотида, алкогольдегидрогиназы, буффера, реагента основного характера, стабилизатора, связывающего альдегид агента с последующим спектрофотометрическим анал1 зом, отличающийся тем, что, с целью сокращепия времени анализа и новыщения его точности, в качестве связующего альдегид агента берут ампнооксиалкановые кислоты, имеющие от 2 до 5 атомов углерода, или аминооксиалкансульфокислоты, имеющие до 4 атомов углерода.