СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ СЕРОТОНИНА В БИОЛОГИЧЕСКИХ ЖИДКОСТЯХ Советский патент 1972 года по МПК G01N33/50 

Изобретение относится к биохимии и касается способа определения серотопина в биологических жидкостях.

Известны способы определения серотонина в биологических жидкостях, например, в плазме, путем перевода его в органическую фазу из тканевого гомогената, промывания, перевода в водную фазу п спектрофлуориметрирования. Эти способы, однако, недостаточно чувствительны и не исключают ошибок определения.

Целью изобретения является увеличение чувствительности и точности метода. Это достигается тем, что серотонин из тканевого гомогената непосредственно переводят в органическую фазу, а в качестве органического растворителя применяют гептиловый спирт.

Для выполнения анализа в центрифужную пробирку с 0,5 мл 3%-ного раствора трилона берут из локтевой вены 5 мл крови и осторожно перемешивают. Для подсчета тромбоцитов крови в лейкоцитарный меланжер набирают кровь до метки 0,5 и до метки 11 3%-ный раствор солянокислого кокаина. Кровь центрифугируют при 45 g и О-5°С в течение 5 мин, 2 мл надосадочной плазмы с тромбоцитами переносят в другую пробирку, из которой аналогично забирают плазму в меланжер для подсчета тромбоцитов. Подсчет проводят через I-3 час после взятия крови или плазмы.

При определеппи серотонина в тромбоцитах отделенную плазму центрифугируют при 1600 g и О-5°С в течение 20 мин. и сливают надосадочную плазму в другую пробирку.

Осадок тромбоцитов (или 2 мл плазмы в случае определения серотонина в плазме) быстро охлаждают до минус 40°С, оставляют на 3- 6 дней п оттаивают. Процедуру замораживания и оттаивания повторяют еще раз, после

tiero к 2 мл плазмы или к осадку тромбоцитов добавляют бидпстиллпрованную воду до 4 мл, перемешивают и прибавляют 4 мл боратного буферного раствора (рН 10,0). Смесь насыш,ают поваренной солью и добавляют 12 мл

гептилового спирта. После перемешивания в течение 10 мин пробирки центрифугируют при 1600 g в течение 10 мин, 10 мл органической фазы переносят в другую пробирку с 1,2 мл 0,1 н. соляной кислоты, встряхивают 5 мин, п

центрифугируют при 36 g в течение 10 мин. В кювету с 1 мл 6 н. соляной кислоты добавляют 1,0 мл водной фазы. Флуориметрпрование проводят при максимуме спектра возбуждения 295 ммк и сканнировании спектра флуоресценции (максимум при 540 ммк) на флуоресцентном спектрофотометре. Одновременно анализу подвергают 0,5 мкг серотопипа, 4 мл бидистиллированной воды и 1 мл надосадочной плазмы без тромбоцитов с добавлением

стандарта. Неспецифическую флуоресценцию реактивов вычитают. Для внесения добавочной поправки на неспецифическую флуоресценцию в кювету с исследуемым раствором добавляют каплю концентрированной перекиси водорода и после смешения смесь повторно сканнируют. Измерение интенсивности флуоресценции плазмы без тромбоцитов и внутреннего стандарта позволяет определить содержание серотонина в исследуемой плазме или осадке тромбоцитов. При подсчете тромбоцитов в крови и плазме можно полученный результат пересчитать на концентрацию.

Предмет изобретения

Способ определения серотонина в биологических жидкостях, например, в плазме, путем

перевода его в органическую фазу из тканевого гомогената, промывания, перевода в водную фазу и спектрофлуориметрирования, отличающийся тем, что, с целью увеличения чувствительности и точности метода, серотонин

из тканевого гомогената непосредственно переводят в органическую фазу, а в качестве органического растворителя применяют гептиловый спирт.